酶联免疫吸附试验 ELISA.ppt

实验四 酶联免疫吸附试验（ ELISA) 免疫标记技术 1. 定义： 将抗原 - 抗体反应与标记技术相结合，用 放射 性同位素、酶或荧光素 标记的已知抗体或抗原，通 过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。 2. 分类： ? 放射免疫测定法： 131 I ， 32 P ? 免疫荧光技术： FITC ， PE ? 免疫酶测定法： HRP ， AP 免疫酶测定法 ( E nzyme I mmuno A ssay,EIA) ? 用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。 – 辣根过氧化物酶 (HRP) ，碱性磷酸酶 (AP) ? 特点： ? 高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性 ? 高灵敏度：酶催化底物显色的高效性， pg 水平微量检测 ? 定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值 ? 分类： ? 酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体 ? 酶免疫组化法： 组织中或细胞表面的抗原。 酶联免疫吸附试验 ( E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay, ELISA) 用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液） 中未知抗体或抗原的方法。 1. 定义 2. 原理 （ 1 ）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连 接（或建立关联）。 （ 2 ）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 – 它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专 一性有机地结合起来，可对生物体内各种微 量有机物的含量进行测定。测定的对象可以 是抗体也可以是抗原。 3. 分类 ? 直接法（ direct ELISA ）： ? 将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体 ? 检测抗体 ? 间接法（ Indirect ELISA ）： ? 将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗 ? 检测 液相中未知抗体 ? 双抗体夹心法（ Sandwich ELISA) ： ? 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 ? 检测液相中的 可溶性抗原 ? 竞争法（ Competitive ELISA) ： ? 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原 或抗体 ? 检测液相中的可溶性 抗原或抗体 （ 1 ） 直接法测定抗原 A. 将抗原吸附在载体表面； B. 加酶标抗体，形成抗原 — 抗体复合物； C. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （ 2 ）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体 , 形成抗原 - 抗体复合物 ; C. 加酶标抗体； D. 加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。 （ 3 ）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面 ; B. 加待检抗原，形成抗原 - 抗体复合物 ; C. 加酶标抗体 ; E. 加底物。底物的降解量＝抗原量。 （ 4 ）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面 ; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 酶联免疫吸附试验 ( E nzyme- L inked I mmuno S orbent A ssay,ELISA) 4. 原理 （以间接 ELISA 为例） ： 显色 间接法测定猪瘟抗体 —— 定性检测 实验材料 ? 猪瘟病毒（ CSFV ） —— 抗原 ? 样品 —— 待测猪血清 ? HRP 标记猪抗兔 IgG —— 二抗 ? 包被缓冲液： 0.025M pH9.6 碳酸盐缓冲液 ? 洗涤液：含 0.05% Tween 20 的 0.01M pH7.4 PBS ? 底物缓冲液： pH5.0 磷酸盐柠檬酸缓冲液 ? 底物溶液： TMB ，底物缓冲液， 30% H 2 O 2 ? 酶标板，酶标仪 间接法测定猪瘟抗体 —— 定性检测 实验方法 1. 抗原的处理： 2. 包被抗原： 取酶标板，加入100μL/孔的抗原稀释液 4℃，湿盒内， 18h 取出包被好抗原的酶标板（ 4 孔 / 组），甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 3. 加待测血清 标记各孔，加入相应液体100μL/孔 1 2 3 4 阴 性 空 白 阳 性 待 测 4. 加二抗： 37℃，湿盒内， 30min 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 各孔加入酶标二抗100μL/孔 37℃，湿盒内， 30min 5. 显色： 甩干孔内液体 以洗涤液（200μL/孔）洗涤 3 次， 3min/ 次 加入底物溶液100μL/孔 避光显色， 10min 6. 观察结果 实验方法