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实验十五 固定化酵母细胞发酵蜂蜜酒 一、实验目的 1. 学习固定化酵母细胞的方法。 2. 掌握蔗糖酶活力的检测方法。 二、实验原理 固相酶又称为固定化酶，是通过物理及化学的处理方法，使水溶性酶和固态的水不溶性支持物(或载体)相结合而制备的。通过酶的固定化可以将酶转变成不溶物同时仍保留酶的活力，在催化反应中具有诸多水溶性酶所不具备的优点。 常用的酶的固定化方法主要有： 1. 物理吸附法；2.载体偶联法(键结合法)；3.交联法；4.包埋法；就其应用技术而言，又分为固定化酶和固定化细胞二种。相对于水溶性酶，固定化酶的优点主要是机械强度增加，稳定性提高，可回收反复使用。 三、仪器和试剂 仪器 试管、1毫升吸管4支、水浴锅、精密酒精计：分度值为0.1%vol、 全玻璃蒸馏器：500mL、高精度恒温水浴：20.0±0.1℃ 试剂 1. 海藻酸钠若干克； 2. K号酵母液； 3. 10％蔗糖液：称取10克蔗糖用水定容至100毫升； 4. 斐林试剂。 四、操作步骤 l、称取海藻酸钠1克加入100毫升水中，微火加热溶解后冷却到30℃左右，将预先准备好的3克卡氏酵母(或K号酵母的培养液30毫升)的悬液加入混匀。 然后倒入下边装有胶管与止血夹的漏斗中，让其慢慢滴入4％氯化钙溶液中，制成直径2－3毫米的球形固定化酵母。 将此固定化酵母装入柱中，从柱上端加入10％的蜂蜜溶液，控制一定的流速，且注意室温要在25~28℃。 2、24小时后测定流出液中的还原糖含量和酒精度。 （1）?葡萄糖测定 ?? ?空白液测定：吸取斐林试剂甲、乙液各5ml，置入150ml三角瓶中，加空白液5ml，并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液，使后滴定时消耗0.1%标准葡萄糖溶液在1ml以内，加热至沸，立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失，此滴定操作在1min内完成。 糖化液测定：准确吸取5ml糖化液代替5ml空白液，其余操作同上。 （2）酒精度的测定 A蒸馏 在20℃±5℃的工作条件下，进行该试验。用一洁净、干燥的100mL容量瓶准确量取100.0mL 样品（液温20℃）于500mL蒸馏瓶中，用50mL水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，再加几颗玻璃珠，连接冷凝器，以取样用的原容量瓶作接收器（外加冰浴）。开启冷却水，缓慢加热蒸馏。收集馏出液接近刻度，取下容量瓶，盖塞。于 B酒精度的测定 将蒸馏液（注入洁净、干燥的量筒中，静置数分钟，待酒中气泡消失后，放入洁净、擦干的酒精计，再轻轻按一下，不应接触（文章来源：华夏酒报·中国酒业新闻网）量筒壁，同时插入温度计，平衡约5min，水平观测，读取与弯月面相切处的刻度示值，同时记录温度。根据测得的酒精计示值和温度，查表，换算为20℃时样品的酒精度（所得结果应表示至一位小数） 五、思考题 1.固定化细胞的方法有哪些？ 2.细胞固定化时选择哪一时期的细胞较好？ 附录一 酵母原生质体融合试验用培养基 (包括酵母单倍体原生质体融合及电场诱导酵母原生质体融合） 1. 完全培养基 葡萄糖 2 g 蛋白胨 2 g 酵母膏 1 g 蒸馏水 100 mL pH 7.2 100 Pa 灭菌20 min。 如需配成固体完全培养基时，则需在上述液体培养基中加入2％琼脂。 2. 基本培养基(用于单倍体酵母原生质体融合试验) (1) 葡萄糖柠檬酸钠培养基 葡萄糖 0.5 g (NH4)2SO4 0.2 g 柠檬酸钠 0.1 g MgSO4·7H2O 0.02 g K2HPO4 0.4 g KH2PO4 0.6 g 纯化琼脂 2 g 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100Pa 灭菌20 min。 (2) YNB 培养基 葡萄糖 2 g 酵母氨基(YNB)* 0.67 mL 琼脂(经纯化处理) 2.0 g 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100 Pa 灭菌20 min。 3. 再生完全培养基 在固体完全培养基中加入0.5 mol/L 蔗糖（或0.8 mol/L 甘露醇或1 mol/L 山梨醇）。 4. 基本培养基（用于电场诱导酵母原生质体融合试验） 葡萄糖 2 g 酵母氨基(YNB)* 0.67 mL 琼脂(经纯化处理) 2.0 g 蒸馏水 100 mL pH 6.0 100 Pa 灭菌20 min。 *YNB 培养基由以下A、B、C 三种溶液混合而成，取A 1 mL，B 1 mL，C 10 mL，无离子水 1000mL， pH6.5。 A 液 维生素混合液VB1 1000 mg，箊酸400 mg，吡哆醇 400 mg，生物素 20 mg，泛酸钙2 000 mg，VB2 200 mg，肌醇10 000 mg，对氨基苯甲酸 200 mg，无离子水l 000 mL。 B 液 微量元素混合液 H3BO4 500 mg，MnSO4·7H2O 20