熊果酸对体外培养小鼠肝细胞的细胞毒性研究.pptVIP

熊果酸对体外培养小鼠肝细胞的细胞毒性研究 报告人：王昊 指导老师：卢静 军需科技学院 食品质量与安全专业 试验物质简介 熊果酸(Ursolic acid,UA)，又名乌索酸，乌苏酸，属a-香树脂醇(a-amyri)型五环三萜类化合物。 熊果酸至少存在于26个科70多种天然植物中。 熊果酸具有广泛的药理作用和重要的生物活性， 其中的抗氧化活性具有重要的研究意义。 试验中所用物质代码总述 PC –空白对照组 UA1 – 熊果酸最高剂量组 UA2 – 熊果酸次高剂量组 UA3 – 熊果酸中剂量组 UA4 – 熊果酸低剂量组 AC – 丙烯酰胺组 研究内容 国内外研究现状 试验目的 试验方法 试验结果 结论 国内外研究现状 目前，已有试验人员通过试验得出了熊果酸对试验动物经口灌胃染毒和经腹腔注射染毒的半数致死剂量，并通过化学毒物毒性等级判定方法得出熊果酸的毒性等级属于低毒。但对于熊果酸的细胞急性毒性剂量还不明确。 试验目的 本试验研究熊果酸在一定稀释浓度下对体外培养的小鼠肝细胞的毒性作用，以及对环磷酰胺、丙烯酰胺、四氯化碳和氯霉素诱导的肝细胞毒性的影响。 试验方法 细胞的分离培养方法 细胞的接种方法 细胞的染毒方法 细胞毒性的检测方法 细胞的分离培养方法 成年清洁级小鼠（1只）→断椎处死 →75%酒精浸泡消毒（10s）→解剖取肝脏→D-Hank’s洗去血污（2-3次）→眼科剪剪碎至糊状→加10倍体积0.1%的胰蛋白酶液→摇床中消化（37℃，10min） →滴加小牛血清终止消化→吸取上清液并离心（1000r/min,1min） →弃上清，加D-Hank’s液至5ml →吹打均匀并再次离心（1000r/min,1min）→如此离心并清洗共3次（第3次用培养基清洗沉淀物）→第3次离心后弃上清留0.5ml,混匀后转入培养瓶→加RPMI1640培养基（含20%小牛血清）→放入CO2培养箱中培养（37 ℃ ，5%CO2条件下) →每隔24h、48h、72h对培养的细胞进行换液 细胞的接种方法 经培养的小鼠肝细胞→ 0.1％胰蛋白酶消化→对经消化细胞用台盼兰染色→计数→计算细胞相对活力→制成5×105个细胞/ml的细胞悬液→用移液器将细胞液接种于96孔板上→ CO2细胞培养箱内孵育24h 细胞的染毒方法 用移液器向96孔板每列孔中加入不同浓度的不同受试物（8复孔） →将加过受试物的96孔板放于CO2细胞培养箱→孵育7h。 细胞毒性的检测方法 染毒孵育结束后→取出96孔板→向每个孔内加入10μlMTT溶液→继续孵育4h 。 孵育结束后→用移液器吸取并弃上清→向各孔加入DMSO，震荡→于酶标仪上读取各孔在490nm处的OD值。 试验结果 对离体细胞的毒性及对丙烯酰胺毒性的影响 对环磷酰胺毒性的影响 对氯霉素毒性的影响 对四氯化碳毒性的影响 测试对丙烯酰胺影响及细胞毒性的培养板 细胞毒性等级及细胞增殖率关系 不同浓度熊果酸毒性对比分析 不同浓度熊果酸对丙烯酰胺的抑制作用分析 不同浓度的熊果酸对3种肝毒物影响效果的比较 结论 熊果酸在本次试验所采用的浓度范围内未出现对肝细胞的毒性作用。可以说，在本次试验所采用的熊果酸浓度范围之内，熊果酸的毒性等级是属于无毒的 。 不同浓度的熊果酸对丙烯酰胺引起的肝损伤情况有显著的抑制作用，各个稀释浓度间无显著性差异； 次高浓度剂量组的熊果酸对于氯霉素所致的肝细胞毒性，无显著性作用，中、低剂量组的熊果酸则有显著的抑制作用； 对于环磷酰胺和四氯化碳所致的肝细胞毒性，不同剂量组皆有明显的抑制作用，且试验发现，随熊果酸浓度的降低，抑制效果有增强的趋势。 * * * * * * 注:*表示P0.05, **表示P0.01 　 - 0 0 - - 　 空白 第12列 - - 0.086 1.113 - - PC 对照组 第11列 丙烯酰胺 1.127 0.085 0.148 1.254 - 0.018/37.4 UA4AC 熊果酸4+ 第10列 丙烯酰胺 1.095 0.051* 0.138 1.219 - 0.18/37.4 UA3AC 熊果酸3+ 第9列 丙烯酰胺 1.19 0.061 0.072 1.255 - 1.8/37.4 UA2AC 熊果酸2+ 第8列 1.182 0.016* 0.139 1.316 457 0.018 UA4 熊果酸4 第7列 1.111 0.019* 0.097 1.237 457 0.18 UA3 熊果酸3 第6列 1.133 0.035* 0.134 1.261 457 1.8 UA2 熊果酸2 第5列 1.034 0.075 0.227 1.151 457 18 UA1 熊果酸1 第4列 0.855 0.000** 0.016 0.952 7