双向凝胶电泳技术 课件.pptVIP

双向凝胶电泳技术 two-dimensional gel electrophoresis technology (2DE) ? 定义一 ：以凝胶为载体的双向电泳。 ? 定义二 ：根据蛋白质的等电点和分子量大小，分别在 凝胶介质二维空间上对蛋白质分子进行等电点聚焦和 电泳来分离与纯化蛋白质的方法。 双向凝胶电泳的原理 ：该技术是在 1975 年由意大利生化 学家OFarrell 发明的。根据蛋白质等电点和分子 量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳。第一向 为等电聚焦（ Isoelectric facusing ， IEF) 电泳，其 基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质 的分离。第二向为十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶 电泳（ SDS), 它是按蛋白质分子量的大小进行分 离的 , 再用考马斯亮兰或 P 银染进行检测，经 Pdquest 等软件对结果进行对比，解析。 2D技术应用中的关键步骤： 1 、样品制备（蛋白提取）： （ 1 ）细胞培养、处理和收集； （ 2 ）将细胞在 IEF 裂解缓冲液中溶解； （ 3 ）将样品离心以去除不容的细胞碎片和 DNA ，提取上 清， - 80 ℃保存。 2 、蛋白质定量和上样： （ 1 ）固相 PH 梯度干胶条（ immobi-linePH Gradient,IPG ）水化、等电聚焦； （ 2 ） IPG 的平衡； （ 3 ） SDS； (4) 蛋白质检测：考马斯亮兰染色或银染色； 3 、图像分析及数据处理： 将染色后凝胶放在 GS-710, 光密度扫描仪上，扫描后的 图像用 PDQUEST 2DE 软件分析，选择部分匹配的蛋白质斑 点进行比较。 制备原则： 由于双向电泳所分析样品的多样性，没有一种通用的制备方法 适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循 （ 1 ）尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在 （ 2 ）避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用 （ 3 ）避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用 （ 4 ）蛋白质样品与第一向电泳的相容性。 蛋白质样品处理： 在制备蛋白质样品的过程中，最好适用 Dnase （脱氧核 糖核酸酶）和 RnaseA （核糖核酸酶）来降解核酸。如果样 品中含有较多的核酸会增加样品的粘性并造成非斑点处的 背景拖迹，甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时， 应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中 蛋白质的溶解性为主要目标。目前增加蛋白质溶解性的方 法主要是适用变性剂，如尿素、硫脲，可以打破蛋白质的 高级结构，打断非共价连接。 双向电泳的应用 双向电泳的分辨率较高，自第一次应用该技术以来，其 分辨率已从 15 个蛋白质点发展到 10000 多个蛋白质点。一 般的双向电泳也能分辨 1000-3000 个蛋白质点。因此，双 向电泳被广泛应用与农业，医学等研究领域。 由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重 要性质，而 2DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差 异分离蛋白质，因此 2DE 的分离能力非常强大，它甚至能 将细胞中 5000 种蛋白分离开， 2DE 在分离蛋白混合样品， 比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查 明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物 学，分子遗传工程，免疫学，微量蛋白质的自动氨基酸序 列分析相结合，可以快速准确的 发现和鉴定新的蛋白质。 双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是： (1) 低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调 节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望 的还是把介质辅助的激光解吸 / 离子化质谱用到 PVDF 膜上， 但当前的技术还不足以检出拷贝数低于 1000 的蛋白质。 (2) 极酸或极碱蛋白的分离。 (3) 极大（＞ 200kD ）或极小（＜ 10kD ＝蛋白的分离。 (4) 难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白 (5) 得到高质量的双向凝胶电泳需要精湛的技术，因此迫切 需要自动二维电泳仪的出现。 Thank you 细胞处理： 对于组织细胞，首先需将其破碎，尽可能地将蛋白质组 分溶解在缓冲液中，以便在适当的电泳条件下分离。 组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融 等。而对于体液成分，如血清、腹水、尿液等，