总RNA的提取和检测 实验报告PDF打印版.pdfVIP

学 海 无 涯 实验二 总RNA 的提取和检测 实验目的 1.掌握从动物组织细胞中提取总RNA 的方法； 2.熟悉紫外吸收法检测RNA 浓度与纯度的原理及测定方法； 3.掌握RNA 琼脂糖凝胶电泳方法并分析总RNA 的电泳图谱； 实验原理 （一）概述 -5 1. 10 µg RNA/细胞含有rRNA 80-85%：28S 18S 5S tRNA, snRNA 10-15% mRNA 1-5% 2. mRNA 3’端存在20-250 个多聚腺苷酸(polyA) 结构，可用oligo(dT)亲和层析柱 分离mRNA 。 3.RNA 分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化 锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA 提取法、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。 4. 目前常用的是Trizol 法。 （二）Trizol 的主要成分 1.Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂，主要成分是异硫氰酸胍和苯酚。异硫氰 酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂 解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。 2.酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA 酶活性，因此Trizol 中 还加入了8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase 。 3.溶解组织细胞的混合物在氯仿作用下溶液分为水相和有机相，RNA 在上层水 相中。 4.取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ；用乙醇沉淀中间层可回收DNA 。 (三)总RNA 的纯度检测原理： 不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被 吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系。RNA 在260nm 紫外光波长处有最大 的吸收峰。 因此，可以用260nm 波长分光测定RNA 浓度，OD 值为1 相当于大约40 μg/mL 1 学 海 无 涯 的单链RNA。用PH=7.6 的TE （tris HCl 缓冲液）稀释RNA 样品n 倍并以TE 为 空白对照，根据此时读出的OD 260 值即可计算出样品稀释前的浓度: RNA (mg/mL) = 40×OD 260 读数×稀释倍数(n)/1000 实验步骤 （一）样品处理与Trizol 用量 1.提取组织RNA 时，每50～100mg 组织（即0.5 ×0.5 ×0.5cm,约合0.1cm3 ）用 1ml Trizol 试剂对组织进行裂解； 2.悬浮细胞先离心沉淀，每5-10×106 个细胞加1mL Trizol 后，反复用枪吹打或 剧烈振荡以裂解细胞。 3.培养贴壁细胞不须消化，可直接用 Trizol 进行消化、裂解，Trizol 体积按 10cm2/mL 比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA 的前提；细 胞数量与Trizol 的比例，细胞的数量不能过多。) （二）操作步骤 1.细胞中加入1 mLTrizol 用移液枪反复吹吸直无明显沉淀后，室温放置5min，使 其充分裂解。（注意：此时可放入-70℃长期保持） 2.按200 μL 氯仿/mL Trizol 加入氯仿，振荡混匀后室温放置2-3min 。(注意：此 步一定要振荡混匀，使氯仿和Trizol 不分层) 3. 4℃12,000g 离心5-10min 。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上 层为无色水相和一个中间层。RNA 主要在水相中，水相体积约为所用 Trizol 试 剂的60 ％。 4.吸取上层水相，至另一新的离心管中。一般 400-450 μL 就足够了，千万不要 贪多！（注：千万不要吸取中间界面） 5.加入与水相等体积异丙醇后，上下颠倒混匀，4 ℃放置5 min 。 7.4 ℃12,000g 离心10 min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 8.加入1 mL 75%乙醇，（在沉淀对面管壁加入，切勿触及沉淀！）盖紧盖子后， 温和转离心管1 周，充分润洗管壁。 9.4 ℃12,000g 离心5 min，尽量弃上清。