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实验五 、总 RNA 抽提与鉴定 【实验目的】 ? 1 、学习总 RNA 分离的原理 ? 2 、掌握 Trizol 法总 RNA 提取的方法 ? 3 、了解各种的不同总 RNA 提取方法 【实验原理】 ? TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试 剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。加 入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。 RNA 存在 于水样层中。收集上面的的水样层后， RNA 可以通过 异丙醇沉淀来获得。在除去水样层后，样品中的 DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式获得。乙醇沉淀能析出 中间层的 DNA ，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。 共纯化 DNA 对于样品间标准化 RNA 的产量十分有用。 ? 无论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组 织 (50-100 mg) 和细胞 (5 × 106) 以及大量的组织 (≥1 g) 和细胞 (107) 均有较好的分离效果。 TRIZOL 试剂操作上的简单性 允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完 成。 TRIZOL 抽提的总 RNA 能够避免 DNA 和蛋白的污染。 故而能够作 RNA 印迹分析、斑点杂交、 poly(A)+ 选择、体 外翻译、 RNA 酶保护分析和分子克隆。如果是用于 PCR ， 当两条引物位于单一外显子内时，建议用 DNase I 来处理抽 提的总 RNA 。 ? TRIZOL 试剂能抽提不同种属不同分子量大小的多种 RNA 。 例如，从大鼠肝脏抽提的 RNA 琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙 啶染色，可见许多介于 7 kb 和 15 kb 之间不连续的高分子量 条带（ mRNA 和 hnRNA 成分），两条优势核糖体 RNA 条带 位于 ~5 kb (28S) 和 ~2 kb (18S) ，低分子量 RNA 介于 0.1 和 0.3 kb 之间 (tRNA, 5S) 。当抽提的 RNA 用 TE 稀释时其 A260/A280 比值 ≥1.8 。 实验一、微藻原生质体的分离 实验目的 1. 了解微藻原生质体分离的原理、方法与技术； 2. 熟练、掌握原生质体分离的基本操作过程。 实验原理 根据藻类细胞脱壁程度的不同， Adamich 将脱壁 后的藻细胞定义为原生质体（ protoplast ）和原生质 球（ spheroplast ）。原生质体是指任何基因型的藻细 胞其质膜外的细胞壁和包被层被全部除去而保持其 余细胞组分的部分；原生质球是任何基因型的藻细 胞其细胞壁被全部或部分除去，仍保留质膜外包被 层的含全部细胞内组分的部分。 海洋微藻因其细胞壁组成的明显差异，原生 质体的分离方法很多，例如蓝绿藻的细胞壁含有 粘肽，因而可以用溶菌酶处理获得蓝绿藻细胞的 原生质体。绿藻的细胞壁主要成分是纤维素，所 以可以用纤维素酶处理而获得原生质体或原生质 球。硅藻和甲藻因其特殊的细胞壁组成和结构， 可用去污剂或富含有机物但缺乏二价阳离子的溶 液处理而达到分离原生质体的目的。红藻和褐藻 则可用多糖酶消化细胞壁成分来制备原生质体。 尽管有这样多的方法，但目前普遍采用的方法是 酶解的方法。 仪器与试剂 1 、 仪器 ①恒温水浴；②低速离心机；③冷冻离心机；④离 心管 40-50ml; ⑤三角烧瓶；⑥显微镜，荧光显微 镜。 2 、试剂与酶 ①酶：纤维素酶（ Onozuka R-10 ） , 离析酶；②浸透 压调节剂：甘露醇、山梨醇和 Nacl ；③密度勾配剂 Ficoll 和蔗糖。 实验步骤 1 、藻株的培养； 2 、原生质体的分离； （ 1 ）取对数期的培养藻细胞（浓度为 5 × 107 细胞 /ml ） 10ml 离心沉淀（ 1000 × g,5min, 室温）。 （ 2 ）用加入 0.85mol/LNaCl 的 MBM 液洗沉淀的藻 细胞一次（ 1000 × g,5min ）。在相同的 MBM 液中 加入 1% 纤维素酶和 0.5% 的离析酶。将洗好沉淀 的细胞在 10ml 上述加酶的培养液中悬浮。 （ 3 ）在振荡器上缓慢振荡（ 20-30 次 /min ）细胞悬 浮液， 30 ℃保温， 1000-2000lx 光照。 （ 4 ）在定时取出 1ml 处理样品，离心分离 （ 1000 × g,5min ），用 MBM 液（含 0.6mol/l 山梨 醇）洗涤一次，离心沉淀后，用 MBM 液（含 0.6mol/l 山梨醇）重新悬浮。 （ 5 ）取 0.1ml 上述悬浮液再悬浮到 0.9ml 蒸馏水中， 显微镜下