GSTpulldown操作流程[共3页].docVIP

GST pull down操作流程 表达GST融合蛋白 1、6mlLB＋单克隆＋Amp，37℃，250rmp培养过夜 2、5ml菌液加入400ml LB＋Amp的1L锥形瓶中中，37℃，250rmp，2h，OD600≈0.6-0.8 3、取1ml菌液保存于Ep管中，sample1 4、大瓶加入400ul（1：1000）IPTG，4h 5、取1ml菌液保存于Ep管中，sample2 6、诱导后的收菌，6000rpm×8min 4度，去尽上清，置于冰上 7、加入20ml，－20度预冷的PBS+1%Triton-100+PMSF（1：100 PMSF）（先加15ml，再加5ml）吹打混匀 8、（1）压力破碎仪破碎 （2）冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总20分钟。至裂解液清澈 9、14000rpm，20分钟，4℃离心，分离上清，取50ul sample3 10、取GST-Beads（400ul）到柱子管中，用预冷的PBS洗去其中的Triton－x－100，加上清（？），4度，旋转孵育1h 如果是小量纯化，就是50ul的GST-beads放EP管， 加细菌裂解液1ml 11、收集50ul的样品sample4，可与sample3作对照，检测beads的结合效率 12、用-20度预冷1％的Triton－x－100 in PBS洗3次，PBS洗3次 1000转 2min，弃上清，留beads等体积的液体（小量PBS是1ml洗，多次） 13、用大枪头剪去少许（beads：PBS=1:1）,吸出10ul跑样，检测纯化情况 14、sample1，2，3，4加sample buffer，100度 10min，12000rmp 30s SDS－PAGE 每样10ul 15、4度保存GST－pro-beads（如果不做pull-down,可以洗脱） sample1：诱导前 sample2：诱导后 sample3：上清 sample4：纯化后上清 裂解细胞 1、收集细胞（胰酶处理好，防止细胞破碎） 1000rmp，5min，RT 2、PBS 洗，离心1000rmp，5min 3、加400ul IP lysis buffer（0.1％Triton）1：100加cocktail 冰上孵育 30min IP Lysis buffer 500ml： HEPES 5.95g Nacl 4.38g EGTA 0.38g PH=7.4 4、针头过5次 5、冰上，旋转孵育，15min 6、14000rpm，20min，4度，留上清，去沉淀 三、表达纯化HIS－tagged protein 1、500ml LB 高温灭菌 2、接种单克隆到5ml LB，加抗生素，37度，250转，过夜 3、把菌液转移到500mlLB,加抗生素中，37度，250转，OD~0.7（看到云雾） 4、加入IPTG 250－500ul，诱导4小时（温度摸索） 5、6000转，4度，15min，弃上清，用10ml lysis buffer 溶解沉淀 6、加入50ul PMSF，超声破碎，（300w，工作5，间歇10，全程10min） 7、12000转，4度，20min 8、柱中加入1ml ni-beads，上清转移至柱中，4度，旋转孵育1小时， （每种蛋白需要自行摸索相应的最佳条件，为防止蛋白降解，以下均在冰上） 小量就是50ul的NI-beads放EP管， 加细菌裂解液1ml 9、用Wash buffer 1 10ml每次，洗2次（小量是1ml洗） 用Wash buffer 2 5ml每次，洗2次（小量是1ml洗） 收集洗脱液 电泳检测每种wash buffer 的最佳用量（防止将蛋白洗脱） 10、用Elution buffer洗脱蛋白2-4次，每次0.5ml，取1ul洗脱液在NC膜上，丽春红染色，颜色越深，蛋白量越大，取蛋白量最大的做Pull down Lysis buffer 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 10mMImidazole Wash buffer 1 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 20mM Imidazole Wash buffer 2 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 40mM Imidazole Elution buffer 50mM NaH2PO4，PH8.0 300mM Nacl 300mM Imidazole Elution buffer 40ml 50mM NaH2PO4 0.312g