碱性磷酸酶米氏常数的测定课件.pptVIP

实验八 碱性磷酸酶米氏常 数的测定 石 巍 一、目的要求 1. 学习分光光度法测定的原理和方法 2. 学习和掌握米氏常数（ K m ）及最大反应速度 （ V m ）的测定的原理和方法，测出碱性磷酸 酶在以对硝基酚磷酸为底物时的 K m 和 V m 值。 二、原理 一、分光光度法的基本原理及方法 （一）利用吸收光谱对物质进行定性分析 1 ．原理 （二）利用吸收光谱对物质进行定量分析 1 ．原理 Beer-Lambert （比尔）定律： T=I/I 0 A=lg1/T=lgI 0 /I A=KCL 其中： T 为透光率； A 为吸光率； I 0 为入射 光强度； I 为透射光强度； K 为吸收系数； C 为溶液浓度； L 为溶液光 程的厚度 2 ．常用方法 （ 1 ）标准曲线法 OD 或Ａ 浓度 ? 标准曲线与样品的测定条件必须一致。 （ 2 ）标准管法 C X /A X =C S /A S ，已知 C S ，测定 A S 、 A X ，可 求得 C X 。 （ 3 ）摩尔吸光系数法 C=A/ ? （ ? 为 L=1cm ， C 为 1mol/L 时的吸 光系数，也称为摩尔吸光系数。 1/v 1/V m -1/K m 1/[S] ? 本实验测定碱性磷酸酶催化对硝基苯磷酸钠盐 (pNPP) 水解的 K m 和 V m. ? 反应式： pNPP+H 2 O pNP+HPO 4 2- 无色 黄色 可通过分光光度法测定产物 pNP 的含量，求出反应速度 v 。 二、分光光度计的使用 仪器操作键介绍 “方式设定”键（ MODE ）：用于设置测 试方式 —— 透射比（ T ）、吸光度（ A ）、 已知样品浓度值（ C ）、已知标准样品斜 率（ F ） “ 100%” 键：用于自动调整 100.0%T(100.0 透射比 ) 或 0ABS( 零吸光度 ) “0%” 键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 3. 样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热 20 分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波 长位置上 ③ 按“方式键”（ MODE ）将测试方式设置为透射比（ T ） ④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 ⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色 皿槽中，盖上样品室盖 ⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“ 0%” 键调透射 比零 ⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“ 100%” 调 100.0 ⑧按“方式键”（ MODE ）将测试方式设置为吸光度（ A ） ⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样 品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。 三、操作方法 （一）对硝基苯酚标准曲线的制作 取 5 支试管编号 ,0 号一支 ,1 － 7 号各二支 , 按下表操作： 管 号 0 1 2 3 4 5 6 pNP 含量 ( ? mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.5 ? mol/mL pNP (mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 H 2 O (mL) 0.8