实验七病毒鸡胚培养成纤维细胞的制备.pptVIP

病毒鸡胚培养 华南农业大学兽医学院微生物学与免疫学实验室 病毒鸡胚培养 一、目的要求： （1）掌握病毒接种鸡胚的途径和操作方法。 （2）掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程， 掌握接毒和收毒的方法。 二、实验材料： 9-11天龄鸡胚、照蛋器、打蛋器、蛋架、铅笔、胶布、孵化箱、0.1%新洁尔灭、剪刀、1mL注射器、新城疫Ⅰ系弱毒 实验用途：鸡胚培养主要用于分离鉴定病毒、培养病毒、制备抗原和制造疫苗。是必不可少的物质。病毒能在易感的组织内增殖，病毒是严格的活细胞内寄生物，其本身缺乏完备而又必须的代谢酸系统和合成病毒蛋白的场所，不能单独进行物质代谢，必须依靠宿主细胞提供场所、原料、能量和必要的酶，同时，细胞上有病毒受体，细胞内没有破坏病毒的酶类，便于病毒 的侵入和存在。因此，病毒不能在任何无生命的培养基内增殖，而只能在活的敏感细胞（如动物机体、禽胚和体外培养的组织细胞）内以复制方式进行增殖。 三、实验的准备 （1）鸡胚的选择 一般都选新鲜、10天以内SPF鸡群的受精蛋 （2）孵育 （注意温度、湿度和翻蛋） 将鸡胚放入孵化箱内进行孵育,气室向上，孵育的最适温度为37.5℃，相对湿度一般为50﹪-60﹪，孵育8日后，鸡胚应每天翻动最少3次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。孵化3-4d，可用照蛋器在暗室观察。鸡胚发育正常时，可见清晰的血管及活动的鸡胚，血管及其主要分支均明显。假如看不到血管或血管消散的是未受精或死胚，是固定在一端不动应剔除。 （３）接种前的准备 （1）病毒接种材料的处理：若液体材料加抗生素在室温作用半小时后高速离心取上清液。若病料是动物组织应剪碎、研磨、离心取上清液，必要时加抗生素处理。 （2） 洗胚：用消毒水清洗卵壳。 　（3） 照蛋: 用铅笔划出气室，胚胎的位置和相应接种的部位。 　 （4） 打孔: 用碘酊在接种处的蛋壳上消毒，并在该处打孔。 (2) 绒毛尿囊膜接法 人工气室法:　取１０－１１日龄鸡胚，在照蛋灯下划出气室位置，并选择尿囊膜发育区作一记号。将胚蛋横卧于蛋座上，作记号的一面朝上。用碘酒消毒记号处和气室，在气室中心部锥一小孔，然后用打蛋器轻锥记号处蛋壳，约０.５ｍｍ深，使其卵壳穿孔而壳膜不破。用洗耳球吸去气室部空气的同时，随即因上面小孔进入空气而绒尿膜陷下形成一个人工气室，天然气室消失。自上面小孔直刺破卵膜进入人工气室约３－５ｍｍ，注入０.１－０.２ｍＬ病料，正好在尿囊膜上。接种完毕用胶布或（熔化石蜡）封闭两孔，人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。 （3）卵黄囊接种: 　 取６－８日龄鸡胚，可从气室顶侧接种，因胚胎及卵黄囊位置而定，也可从侧面钻孔，然后接种。注入０.１－０.２ｍＬ病料。接种完毕用胶布或（熔化石蜡）封闭，人工气室向上，横卧于孵化箱中，逐日观察。 （4）羊膜腔接种 开窗法:　从气室处去蛋壳开窗，从窗口用小镊子剥开蛋膜，一手用平头镊子夹住羊膜腔并向上提，另一手注射０.０５ｍＬ－０.１ｍＬ病料入腔内，然后用胶布或（熔化石蜡）封闭人工窗，使蛋直立孵化。 盲刺法:　将鸡胚放在灯光向上照射的蛋座上，将蛋转动使胚胎面向术者。在气室顶部到边缘的一半处打一孔，用长４０ｍｍ长的针头垂直插入，约３０ｍｍ以上。如已刺入羊膜腔，能使针头拨动胚，即可注入病例液０.１－０.２ｍＬ。拔出针头后用胶布或（熔化石蜡）封闭小孔。置孵化箱中培养。 五、接种后检查 　 接种后２４ｈ内死亡的鸡胚（误伤或细菌污染），应该弃去，２４ｈ后，每天照蛋２次，如发现死亡立即放入4℃冰箱（让血管收缩），过１－２天取出鸡胚收取材料并检查鸡胚病变。 六、鸡胚材料的收获（原则上接种什么部位，收获什么部位） （１）尿囊腔接种收获时，用碘酒将气室部卵壳 消毒，将气室处卵壳剥去，（不要将碎片落入壳膜）然后用无菌镊子从胚胎背部轻轻下压，（切勿压破卵黄囊）用收获针头或（吸管）吸取尿囊液，收集的液体应该是清亮的，混浊则表示有细菌污染。取两滴尿囊液滴于斜面培养基上放在培养箱培养作无菌检查。 （２）羊膜腔内接种首先收完尿囊液，后用注射器带针头插入羊膜腔内收集，约可收到１ｍＬ液体，无菌检查合格保存。 （３）卵黄囊内接种首先收完尿囊液和羊膜腔液，后用吸管吸卵黄液。无菌检查同上。并将整个内容物倾入无菌平皿中，剪取卵黄膜保存，若做卵黄囊膜涂片时，应于此时进行。 最后进行鸡胚的无害化处理。 鸡胚成纤维细胞的制作与培养 实验八 实验目的：了解原代细胞培养的原理，掌握鸡胚成纤维细胞的体外培养方法。 实验用途：细胞培养是病毒学研究的重要手段，是进行病毒性疾病诊断必不可少的工具。病毒能在易感的组织和单层细胞内增