质粒dna的小量提取及dna琼脂糖凝胶电泳实验报告.pdfVIP

质粒 DNA 的小量提取及DNA 琼脂糖凝胶电泳 一、前言 质粒 质粒是附加到细胞中的非细胞的或核区原有的能够 自主复制的 较小的 DNA 分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。大部分的质粒虽然都 是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为）中，乃至于 植物的等胞器中。然而， 1984 年，在 Streptomyces coelicoler()等以及 在 Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形 质粒 天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基对都有 质粒 天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至 于数种的质粒同时存在 质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能 有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗基因的质 粒)。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃 至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿 主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体 质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型 前者只在细胞周期的一定 段进行复制，当染色体不复制时，它也不 能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如 F 因子。后 者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝， 一般在 20 个以上，如 Col E1 质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素 时，细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧 密型质粒复制停止，而继续复制，可由原来20 多个扩增至 1000-3000 个，此时质粒 DNA 占总 DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50% 把一个有用的目的 DNA 片段通过重组DNA 技术，送进受体细胞 中去进行繁殖和表达的工具叫载体 细菌质粒是重组 DNA 技术中常 用的载体 质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构 质粒还带有某 些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及 所携带的遗传信息在重组 DNA 操作，如扩增、筛选过程中都是极为 有用的 质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工 构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择 性标记基因(如抗生素)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别 位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可 能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助 序列，这些用途包括通过方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定 的单链 DNA、外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大 量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性:⑴分子量小、 多拷贝、松弛控制型;⑵具有多种常用的限制性内切酶的单切点;⑶能 插入较大的外源 DNA 片段;⑷具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定 和筛选。⑸对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在 1kb 至 10kb 之间，如 PBR322、PUC 系列、PGEM 系列和 pBluescript(简称 pBS)等 质粒的不兼容性 利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在， 当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的 过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞 中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失， 因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基 团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷 却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小 和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛， 常用于凝胶层析和 电泳 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不 含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半 乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的 凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼 脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析