定量PCR技术4学习资料.pptVIP

定量PCR技术 ;简单介绍;定量PCR 理论部分;定量PCR实验部分;The End;设计PCR反应引物;总RNA的提取;RNA完整性检测;RNA纯度检测;合成cDNA的引物的选择;PCR反应;相对RT-PCR的PCR扩增; 3）相对RT-PCR的内对照一般用看家基因，这样可使对样品进行处理和变换细胞类型时，内对照的表达不受影响。其次要求内对照的表达水平要与目的转录本的表达水平相似，这可以在扩增体系中添加竞争子来削弱看家基因的信号。竞争子是一些经过修饰无法延伸的引物。通过实验确定引物：竞争子的比例来模拟目的转录本的量，一旦这一比例被确定，他就可以和线性范围的循环参数一起对RNA样品中的转录本的量进行定量。; 样品和内对照同时进行单链cDNA合成反应，之后加入到反应管中同时进行PCR的扩增，然后用变形凝胶来分析实验结果。定量样品PCR产物的相对含量，可以用基因特异性产物的信号除以内对照的信号，从而可以得到每个样品中基因特异产物的准确相对值。这些值可以用来比较样品间模板RNA的相对表达量。 ;竞争性RT-PCR的PCR扩增; 之后，将选择出的拷贝数2倍梯度稀释重复上述过程，以便在数据上得到更高的分辨率。 为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制，要做一个最终的RT-PCR实验，在这个实验中样品RNA和竞争子RNA