folin-酚试剂法测定蛋白质含量.docVIP

　　 　 Foliｎ-酚试剂法测定蛋白质含量 实验目的 １,掌握Folin－酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其具体实验操作技术； ２,掌握制作标准曲线的要领; 3,学会通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。 实验原理 1,蛋白质分子中含有的肽键在碱性条件下可以与 Cu2+螯合形成蛋白质- Ｃｕ２+复合物，即发生双缩脲反应。而此复合物中的含酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基可以还原Ｆoｌin-酚试剂的磷钼酸盐-磷钨酸盐，产生蓝色化合物(钼蓝和钨蓝的混合物),即发生Folin-酚显色反应。同时，在碱性条件下Ｆｏliｎ-酚试剂极不稳定,从而易被蛋白质还原而呈蓝色反应。 　 2,在一定浓度范围内，蓝色化合物的蓝色深浅与蛋白质浓度呈正比。故通过测定相应浓度梯度的蛋白质标准溶液吸光度可依其作出标准曲线，以此绘制的标准曲线和供试品中蛋白质溶液吸光度可求出供试品中蛋白质的含量。 材料和方法 样品：健康人血清(300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量:60～80 g/L 试剂：牛血清白蛋白标准液(20０μｇ/ｍl)；碱性硫酸铜溶液（现配）;Ｆoｌin－酚试剂 仪器与器材：　Ｖ－1100分光光度计； 恒温水浴箱;试管６支、试管架; 加样枪、加样枪架； 坐标纸 实验步骤示意 冷却至室温40℃水浴10min2s内混 冷却 至室温 40℃ 水浴 10min 2s内混 合均匀 加酚 试剂 混合均匀 静置10min 蛋白 标 准液 比色碱性硫酸铜溶液 比色 碱性硫 酸铜溶液 详细步骤 A，配置一定浓度梯度溶液: 取6支试管分别编号1至6，按下表加样。（1作空白对照，2-５作标准，6为待测样品) 1，加样时按横向顺序加样，并在加入碱性硫酸铜时:于一号试管加入碱性硫酸铜溶液2ml后等待一分钟再往下一支试管加入同量的碱性硫酸铜溶液,摇匀。如此类推混匀并将其静置在室温下。 试剂(ｍl) 空白管 标准管 样品管 1 2 3 4 5 ６ 牛血清蛋白标准液 - 0.2０ 0.40 0．６０ 0.８0 － 样品液（稀释30０倍) - - - - - 0．50 蒸馏水 碱性硫酸铜 Fｏlｉn-酚试剂 蛋白质浓度(μg/ｍl） 1．０ 2.0 0.20 ０ ０.８0 ２.0 0.２０ ４0 ０．６0 2.0 ０.20 8０ 0．40 ２.0 0.20 120 ０.20 2.０ ０.２０ 160 0.５0　 2．0 0.2０ 未知　 　 2,在全部试管加完碱性硫酸铜试剂之至距第一支试管加样１０分钟后，于第1支试管立即加入０．２0mL　Ｆolｉn-酚试剂，并于2s内摇匀。1分钟后第2支试管加入０.２0mL Folｉn－酚试剂,2分钟后加第３支试管,以此类推。 B,加样完毕后将各试管每隔1mｉn按1-6顺序放一只试管入水浴箱,分别４0℃水浴1０mｉn后取出冷却至室温。 C，以50０nｍ波长比色,以1号管作空白对照,按2-6顺序每隔一分钟测定一支试管内溶液吸光度并重复测三次，记下读数,求出平均值，记录数据并计算结果。 四、结果与讨论: 结果： A,实验过程现象: 1，在向试管中加入２ml碱性硫酸铜溶液并摇匀后,溶液澄清,无明显现象; 2，在向试管中加入0.20mL Ｆｏlin-酚试剂并立即摇匀时观察到：溶液由浅绿立即先变黄后变浅蓝，且蓝色随时间延长而有所加深。 B，吸光度数据：　 　 ５00nm波长吸收度值记录 测定次数 各管吸光度值Ａ500 2 3 ４ 5 6 1 0.063 ０.119 ０.173 ０.2２2 0.148 ２ 0.０５9 0.１１９ 0.1７1 0.219 0.１5０ 3 0.０6４ 0．118 0.１7５ ０．２1２ 0.１40 各管平均值500 ０.０62０ 0．1187 0.1730 ０.２１77 0．146 （对照组的实验数据均为0) 试管 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液浓度(μg/mｌ) - A50０平均值 0 0.０62０ 0.11８7 0.1７3０ ０.2177 0.146 根据吸光度数据绘制图表： 　　 将测得样品管吸光度0.１46０代入标准曲线公式y=0.０013x+0.０１25中,得出样品浓度为１02．7μg/mｌ。 即:?C（未稀释蛋白含量) = Ｃ(稀释后蛋白质含量）×2×３0０ ?? 　 　 　= １02．７μg/mｌ×６00 ? =　61.６2μｇ/ｍl ＝　6１.62ｇ/Ｌ 正常人血清蛋白浓度参考范围为:60～８0g／L 以上依赖所得实验数据分析得出的待测蛋白浓度落在正常范围内，可认为本次实验成功。 讨论： A：本次实验中操作严格按照实验要求进行,故所测样品结果6１．62g/L落在正常范围内。与同实验室另一小组所测结果(61.8０g/L）相比差距很小,故可认为