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第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 第二节 检测抗原和抗体的体外试验 第三节 免疫细胞功能的测定 第 22 章 免疫学检测技术的基本原理 1 2020/4/27 第一节 体外免疫反应的特点及影响因素※※ ( 一 ) 抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 特异性越强，亲和力也越高； 2. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间 结构互补外，主要以氢键、静电引力、范德华力和疏水 键等非共价结合。不如共价键稳定，易受温度、酸碱度 和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有 特性； 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例 决定抗原抗体结合后能否 出现肉眼可见的反应； 4. 抗原抗体反应的 2 个阶段 第 1 阶段是抗原抗体特异性结 合，可在数秒钟至几分钟内完成；第 2 阶段是小的抗原 抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间 从数分钟至数日不等。 2 2020/4/27 ( 二 ) 抗原抗体反应的影响因素 1. 电解质 抗原抗体等电点分别为 pH3-5 和 pH5-6 ，在中性 或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解 质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 2. 温度 通常为 37 ℃ ，适当提高反应温度可增加抗原与抗 体分子的碰撞机会，但 56 ℃ 以上可使抗原或抗体变性失 活； 3. 酸碱度 抗原抗体反应的最适 pH 值在 6-8 之间， pH 值过 高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当 pH 值接 近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸 引而出现凝集，导致非特异性反应。 3 2020/4/27 第二节 检测抗原和抗体的体外实验 抗原抗体反应 凝集反应 直接凝集 间接凝集 沉淀反应 免疫比浊 单向免疫扩散 双向免疫扩散 免疫电泳 蛋白芯片 技术 免疫标记 荧光 酶 同位素 化学发光 胶体金 免疫印迹 4 2020/4/27 Ab Ag 高亲和力 Ab Ag 低亲和力 特异性 结合力的表示方法 亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab 反应的原理 5 2020/4/27 Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络 Ag-Ab 反应的可见性 6 2020/4/27 1. 凝集反应 直接凝 集反应 1:2 稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性 Ag 或表面包被抗原的颗粒状物质与相应 Ab 在电解质存在的 情况下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。 玻片法 试管法 常用于菌种鉴定或 ABO 血型鉴定 常用于检测抗体的滴 度或效价，见于临床 诊断伤寒或副伤寒所 用的肥达氏反应和诊 断布氏菌病所用的瑞 特试验。 7 2020/4/27 间接凝集反应 将可溶性 Ag/Ab 先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应 Ab/Ag 进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素 O 吸附于乳胶颗粒上的 抗“ O ”试验、人 IgG 作为 Ag 吸附于乳胶颗粒上的类风湿因子检测。 凝集反应常用于溶血性疾病的诊断： + 病人的 RBC 体内 anti-Rh 由于抗体多属于 IgG ，分子 量较小，抗体与红细胞间的 结合力不能克服细胞间的排 斥力，不出现凝集 + 体外加入 抗人 IgG 出现凝集现象， 叫 直接库姆试验 正常人 O 型血 的 Rh+ 的 RBC + 患者血清内的 游离 anti-Rh + 体外加入 抗人 IgG 出现凝集现象， 叫 间接库姆试验 8 2020/4/27 2. 沉淀反应 Ag Ag Ag Ag Ab in gel 单向免疫扩散 Ag1 Ab Ag2 Ag3 Ag4 双向免疫扩散 免疫比浊 过量 Ab Ab Ab Ab 毒素、组织浸液及血清中的蛋白等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼可见的沉 淀物，称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，也可在半固体琼脂凝胶中进行。 鉴定多种抗原是完全相同、 部分相同或完全不同 用于确定 抗原浓度 9 2020/4/27 沉淀反应 — 免疫电泳 存在于不同区域的抗原与抗 体结合，在比例适宜处形成 沉淀弧。沉淀弧的数量、位 置和形状与标准品相对比， 可分析样品的成分及其性质。 10 2020/4/27 3. 免疫标记技术 ① 免疫酶测定法 ② 免疫荧光技术 ③ 放射免疫测定法 ④ 免疫胶体金技术 11 2020/4/27 ①免疫酶测定法 a) 夹心法 ELISA b) 间接 ELISA c) BAS — ELISA 利用生物 素和抗生物素蛋白为桥梁 d) 微粒捕获酶免疫分析技术 将已知特异性抗体致敏的 免疫微粒与生物素、