工业微生物菌种地选育——诱变选育(1).doc

工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 工业微生物菌种的选育——诱变选育（1） 诱变选育 诱变育种是指利用各种诱变剂的物理因素和化学因素处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，使用普遍。诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 诱变育种的步骤与方法 （一）、工业育种的一般步骤（图） （二）、诱变育种方案设计 诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。 1、出发菌株的选择 工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株。出发菌株选择目前主要依据实际经验，总结如下： ①以单倍体纯种为出发菌株； ②采用具有优良性状的菌株；③选择对诱变剂敏感的菌株；④许多高产突变往往要经过逐步累积的过程，才变得明显，所以有必要多挑选一些已经过诱变的菌株为出发菌株，进行多步育种，确保高产菌株的获得。 2、出发菌株的纯化 为什么要对出发菌株进行纯化呢？这是因为微生物容易发生变异和染菌，同时一般丝状菌的野生菌株多为异核体。生产菌在不断移代过程中，菌丝间接触、吻合后，易产生异核体、部分结合子、杂合二倍体及自然突变株等。这些都会造成细胞遗传物质的异质化，使遗传性状不稳定。通过纯种分离，从中挑选所需的优良菌株。常用划线分离和稀释分离法，并结合显微镜操纵器分离单孢子。 3、单孢子悬液的制备 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状态的单细胞悬液。 首先是细胞的生理状态对诱变处理也会产生很大的影响，如细菌在对数期诱变处理效果较好；霉菌或放线菌的分生孢子一般都处于休眠状态，所以培养时间的长短对孢子影响不大，但稍加萌发后的孢子则可提高诱变效率。 其次是分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落。由于在许多微生物的细胞同时含有几个核，所以即使用单细胞悬浮液处理，还是容易出现不纯的菌落。若诱变剂产生的突变只在 DNA双链中的某一条单链，故该突变无法反映在当代的表型上。只经过DNA的复制和细胞分裂，表型才会发生变异，出现不纯菌落，这就叫表型延迟 (phenotypic lag) 。不纯菌落的存在，也是诱变育种工作中初分离的菌株经传代后很快出现生产性状 “衰退”的主要原因。 （1）供试菌株的孢子或菌体的选择 供试细胞要新培养的，细胞生理活性既要同步，又要在最旺盛的对数期，这样突变率高，重现性也好。对细菌来说，常常通过前培养达到要求。菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子，不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象发生。在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉或滤纸过滤。 菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞 10 6 ~ 10 7 个/ml，放线菌或细菌10 8 个/ml。菌悬液一般用生理盐水（0.85%NaCl）稀释。有时，也需用0.1mol/L磷酸缓冲液稀释，因为有些化学诱变剂处理时，常会改变反应液的pH值。 （2）菌悬液制备方法 细菌：在诱变处理前进行摇瓶振荡培养，利用温度和碳源控制其同步生长，离心洗涤，用冷生理盐水或缓冲液制备菌悬液，放在有玻璃珠的三角瓶振荡10min，用无菌脱脂棉或滤纸过滤，通过菌体计数，调整菌悬液的浓度。孢子：在试验中尽量采用成熟而成熟的孢子，并置于液体培养基中振荡培养到孢子刚萌发，即芽长相当孢子直径0.5－1倍。离心洗涤，加入生理盐水或缓冲液，振荡打碎孢子团块，以脱脂棉过滤，计数，调整菌体浓度供诱变处理。对不产孢的真菌，可直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。 4、诱变剂的种类和选择 A、诱变剂种类的选择 物理诱变剂包括：各种射线，如紫外线（焦耳）、X射线（库仑/千克）、β射线、γ射线、α射线和超声波等；化学诱变剂包括 甲基磺酸乙酯（EMS）、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。 选择诱变剂要根据诱变剂作用机制，结合菌种特性来考虑选择哪种诱变剂 ，同时要考虑菌种特性和遗传稳定性。同时还要参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂。对遗传稳定的菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂进行复合处理，然后再采用一些作用较缓的诱变剂处理。对遗传不稳定的菌株，首先进行自然分离，划分菌落类型，从中选择效价高的、性能好的一类菌落作为诱变处理的出发菌株。采用温和诱变剂或对该类菌剂进行继续处理，从中筛选突变体。并结合自然分离和环境条件的改变，使有效的菌落类型不断增加，成为正常型菌落。在诱变之前还要考查出发菌株的诱变系谱，详细分析，总结规律性，选择一种最佳的诱变剂。 B、最适