第二章 质粒DNA的微量提取SDS法.ppt

实验二 质粒 DNA 的微量提取 碱裂解法 （ SDS 法） 一 . 目的与要求 通过质粒的一些基本特性、质粒 DNA 的提取 技术，掌握用碱变性法提取质粒 DNA 的技术。 二 . 相关知识 质粒 (Plasmid) ： 独立 于染色体外的，能 自主复制且稳定遗传的遗传因子。绝大多数是 一种 小型的、环状 的双链 DNA 分子。 广泛存在于细菌、放线菌、真菌以及一些 动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小 从 1Kb-200Kb ，它们复制时利用宿主细胞复制自 身基因组 DNA 的同一组酶系。 质粒 DNA 的存在区域和结构特征 电镜中质粒 DNA 的形态 ? 严谨型： 质粒的复制受到寄主细胞 严格 控制，与寄 主细胞的复制偶联同步。因此，在一个细胞中只有 1 个或几个 拷贝； ? 松驰型： 质粒的复制是在寄主细胞的 松弛 控制之下 的，每个细胞中含有 10-200 个 拷贝。 用一定的药物处理，抑制寄主蛋白质的合成才 会使质粒拷贝数增至 几千份 。 质粒 pBR322 即属于松 弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。 质粒类型： 载体 (Vector) ： 用于携带 重组 DNA ，并且能够使外源 DNA 一起复制或 表达的质粒 ( 运载工具 ) 。具备的条件 : 1. 具备条件 （ 1 ）易于鉴定； （ 2 ）在受体细胞中 可以独立复制； （ 3 ）易于筛选； （ 4 ）易于导入受体细胞。 2. 结构特征 (1) 抗性基因 （ Ampicillin gene, Kanamycine gene) (2) 启始复制子 （ ori ) ； (3) 多克隆位点 (MSC) ； (4) 标记基因 ( LacZ gene) 。 Insert Eco RI Xho I 1.9kb DNA 是具有一定结构的物质，特殊的环境会导致 DNA 的变性，如加热、 极端 pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使 DNA 复 性。 三 . 原理： SDS 是一种阴离子表面活性剂，既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋 白质变性，所以 SDS 处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使 质粒 DNA 以及基因组 DNA 从细胞中同时释放出来。释放出来的 DNA 遇到强碱 性（ NaOH ）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾中和溶液，使溶液处 于中性，质粒 DNA 将迅速复性，而基因组 DNA ，由于分子巨大，难以复性。 离心后，质粒 DNA 将在上清中，而基因组 DNA 则与细胞碎片一起沉淀到离 心管的底部。 四 . 细菌裂解的方法： (1) 碱裂解法 ： 0.2molNaOH+1%SDS;(2) 煮沸裂解法 : 沸水煮沸 40s;(3) SDS 裂解法 ： 10%SDS, 用于质粒大量提取。 五 .DNA 浓度的测定： (1) 分光光度计法 : 碱基 (G,A,T,C ）在 260nm 处具有强吸收峰，一般在中 性 pH 值左右的环境中进行测定。这种方法常测定比较纯的样品。 (2) 荧光的强度法： (3) 凝胶电泳比对法，与标准分子量相比较。 六 . 材料和仪器 1. 材料 : 含有质粒 P3.5K-EGFP 的大肠杆菌 DH5 α。 P3.5K-EGFP 是一种酵母 荧光表达载体，常用于检测酵母中外源基因表达强度和亚细胞定位。 2. 试剂： 裂解液一， 裂解液二，裂解液三，酚氯仿，异丙醇， 70% 乙醇， TE 等。 3. 仪器设备： 高速离心机，移液器，摇床等 4. 加入 400 ? l 新配制的裂解液二，加盖颠倒 6-7 次使 之混匀，放置 3-5min （不得超过 5min ） ; 七 . 质粒微量提取的方法 培养细菌 收集菌体 悬浮菌体 裂解菌体 1. 将带有质粒的 DH5a 接种到 3-5ml 含有 amp 抗生素的 液体培养基， 37 ℃培养 12-16h; 2. 取液体培养液 1.4ml 于 Ep 管中， 10000rpm 离心 1min ，去掉上清液，重复步骤 2 ； 最后瞬时离心后 ，用移液器去除上清。 （所有去除残液均用此法） 3. 加入 200 ? l 裂解液一，涡旋混匀放置 5min; 5. 加入 350 ? L 裂解液三 ( 乙酸钾溶液 ) ，加盖后颠倒 6- 7 次混匀，放置 3-5min; 中和复性