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Western Blot 实验计划完整版
一、SDS
1、分离胶的配制
10% 10%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 2.67 mL 4.005mL
去离子水 3.33 mL 4.995mL
分离胶缓冲液(4X) 2.00 mL 3.00mL
8.00 mL 12.00mL
10%(w/v)APS(现用现配) 45μL 67.5μL
TEMED 12μL 18μL
2、压缩胶的配制
3%
30:0.8丙烯酰胺/双丙烯酰胺 0.75 mL
去离子水 3.00 mL
压缩胶缓冲液(4X) 1.25 mL
5.00 mL
10%(w/v)APS(现用现配) 30μL
TEMED 8μL
先制备蛋白样品,后灌注压缩胶,压缩胶灌注后应在20~40min内使用。
3、蛋白样品的制备
蛋白样品 8μL
上样缓冲液(loading buffer/laemmili buffer) 12μL
煮沸5min
冷却至室温
短暂离心
之后可加样,加样孔的深度至少为5~8mm。
拔出梳子后,如加样孔有气泡,可向其中加入适量电泳缓冲液将气泡驱除
从烧水开始,蛋白样品的制备大约需要35min
4、电泳
压缩胶电压:80V(10mA)
分离胶电压:120V(20mA)
当溴酚兰指示剂到达凝胶底部时,即停止电泳。
5、染色
考马斯亮蓝染色液35min,摇床摇动(为获得最大分辨率,5%凝胶染色2小时,10%凝胶染色4小时)
用清水反复漂洗几次
高甲醇脱色液25min,摇床摇动(也可用7%(v/v)冰乙酸)
低甲醇脱色液,摇床摇动
二、Western blot
1、润湿
准备6张Whatman 3#滤纸、一张硝酸纤维素膜,尺寸与凝胶大小相仿,先放入水中3分钟,放入转膜缓冲液中5分钟。
2、起胶
将凝胶从电泳槽中取出,放入转膜缓冲液中10分钟
3、三明治的制作
按以下顺序放置:3层Whatman 3#滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、3层Whatman 3#滤纸
切记:每层之间用滴管将其中的气泡全部赶出,决不允许气泡存在。
4、海绵的润湿
用转膜缓冲液将海绵润湿
5、转膜
将凝胶面与负极相连,硝酸纤维素膜与正极相连。(100V,1小时)要放于4℃。
For transfer of proteins smaller than 20 kDa, transfer proteins from gel to PVDF (polyvinylidene difluoride) membrane at 1Amp constant current for 45 mins or equivalent (250mAmp for 3 hours or 500mAmp for 90 minutes) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
For transfer of proteins smaller than 120 kDa, transfer proteins from gel to PVDF membrane at 1Amp constant current for 1 hour or equivalent (250mAmp for 4 hours or 500mAmp for 2 hours) in transfer buffer (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH).
For proteins larger than 120kDa, transfer to PVDF membrane at 1Amp constant current for 90 minutes or equivalent (250mAmp for 6 hours or 500mAmp for 3 hours) in transfer buffer + SDS (25mM Tris, 190mM glycine, 20% MeOH, 0.05% SDS).
For Proteins larger than 25
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