封闭群裸鼹鼠的微卫星DNA标记检测方法.pdf

DBXX/XXX-20XX 封闭群裸鼹鼠的微卫星 DNA 标记检测方法 1 原理 采集封闭群裸鼹鼠的血液或组织，提取基因组 DNA。对特定的微卫星标记座 位进行 PCR扩增，通过遗传分析仪检测各座位基因的峰形和大小，确定各微卫 星标记的遗传概貌。 2 仪器设备 2.1 常压电泳仪 2.24℃、-20℃冰箱 2.3 低温高速离心机 2.4 水浴锅 2.5 分析天平 2.6 pH 计 2.7 紫外分光光度仪 2.8 PCR仪 2.9 毛细管电泳仪（ STR） 3 检测方法 3.1 样本的采集 采集约 0.1 g 组织或 0.5 mL 血液，放入 75%乙醇保存。 3.2 基因组 DNA的提取 用酚-氯仿萃取法或试剂盒提取基因组 DNA。 3.3 微卫星位点 用 25 个裸鼹鼠微卫星位点检测封闭群裸鼹鼠的遗传概貌。各微卫星位点的 名称、引物序列、等位基因数、镁离子浓度及等位基因分布范围见表 A1。 3.4 PCR 扩增 3.4.1 PCR 扩增的体系 PCR总反应体积为 30 μL，其中含 10×PCR缓冲液 3 μL，各组分的终浓度为 0.05 U TaqPolymerase/ Lμ，250 μM dNTP，50mM KCl，特异性引物 (R 链， F 链 )0.2 μM， 1 DBXX/XXX-20XX 0.5 μL DNA模板（ 30~60 ng），纯水补齐反应体积。 PCR反应程序为： 94℃预变性， 3min；94℃变性， 30s；退火温度（各位点 退火温度参见表 A1），30s；72℃延伸， 30s；30 个循环； 72℃继续延伸 5min ； 扩增产物 4 ℃保存。 3.4.2 PCR 产物的检测 PCR产物，经 1.5％的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。 3.4.3 扩增产物的 STR扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片段后 ，选择分别以 FAM、 HEX标记的两个位点的扩增产物，以 1:1.5 体积比混合，取 1 μL上样进行 STR扫 描。 3.5 STR 扫描结果的判读与统计分析 3.5.1 STR 扫描结果的判读 扫描结果出现两种波形：一种为纯合基因型，只有一个主波；另一种为杂合 基因型，有两个主波。同时，根据软件读出波峰处的扩增产物的 bp 数。 由基因分型软件读出每个样本在每个微卫星位点的扩增片段大小。每个位点 的等位基因根据扩增片段从小到大顺序排列记录为 a,b,c,d 等。… 3.5.2 运用群体遗传分析软件对数据进行统计分析 将所有样本的每个微卫星位点的基因型以 ab,bb 等形式输入群体遗传分析软 件的数据文件，计算样品在各微卫星位点上的基因频率、平均观察等位基因数、 平均有效等位基因数（ Ne）、香隆指数、平均杂合度（ H）等。 3.6 结果判断 平均杂合度在 0.5～0.7，且期望杂合度与观测杂合度经卡方检验无明显差异 时，判定为裸鼹鼠封闭群。或者，首先得到各个位点上各基因频率、基因型频率 的实际值，然后计算出基因频率和基因型频率的预期值 。用实际值和预期值比较 ， 通