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PCR 污染防治手册 一、 为什么要如此重视防治PCR 污染？ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 片段 的方法。扩增过程中，扩增的DNA 产量是呈指数上升的。PCR 产物的浓度一般为1013 拷贝 6 /ml ，而 1mg 人基因组DNA 才含 1.4*10 拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR 扩增反应 的敏感性非常高。正是由于PCR 反应具有强大的扩增效率也导致其及易污染，极微量的PCR 产物污染便可导致假阳性结果。在应用HPV 分型试剂盒的过程中，主要存在两个污染源： 1.标本间的交叉污染； 2.PCR 扩增产物的污染。其中以第二个污染源为最为常见，通过下 面一个例子便可认识到PCR 产物污染的严重性。在 100ml 的反应管中可产生1012 拷贝个分 子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池（50m*25 m *2m ）内稀释后，0.1 ml 稀释液 含有400 拷贝的扩增分子，远远超过了PCR 扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，一定要 注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。 二、 PCR 污染的来源 对于HPV 分型检测试剂盒来说，污染的来源主要是PCR 扩增产物的污染，常见的污染 途径有两种，一是气溶胶污染，在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈 地摇动反应管，开盖时、吸样时及受污染的进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计 算一个气溶胶颗粒可含48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。二是 PCR 产物的粘带污染，此类污染多是因为没有严格遵守分区规定，造成PCR 产物扩散到样 品抽提或PCR 实验室。实验大衣、手套、移液枪、枪头、枪头盒和试管架都是常见的粘带 污染源。污染发生时，这些地方是重点怀疑的地方。 三、 PCR 污染的追踪 如果不慎发生或者怀疑有污染发生，可以设计一个简单的小实验以确认污染源。 用HPV 的PCR 扩增系统扩增如下模板： A:水作为阴性对照，如果此管扩增出阳性，则可以判定为试剂已经污染或者是气溶 胶污染。 B:阳性样品作为阳性对照，验证实验是否成功。 C-X:所要检查的地方，用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源，0.1ml 去离子 水浸泡后作为模板。常见的需要检查的地方为各个实验台面、移液枪、枪头、枪头盒、试管 架、冰箱内、冰箱把手、水浴锅、抽提的相关试剂以及相关人员的办公桌。 如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR 产物 的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，可以在室内加装紫外灯管照射 过夜且彻底通风并停止几天的实验。 四、 PCR 污染的预防 进行PCR 操作时，操作人员应该严格遵守一些操作规程，最大程度地降低可能出现的 PCR 污染或杜绝污染的出现。 1 1、划分操作区：实验操作在三个不同的区域内进行，PCR 的前处理和后处理要在不同的隔 离区内进行, 最基本的一个原则就是PCR 扩增及杂交检测区的东西是属于污染源，绝对不可 以带到前两个区去。 A：样品制备区，包括扩增摸板的制备； B：PCR 加样区，包括反应液的配制和PCR 扩增； C：PCR 扩增及杂交检测区,杂交操作过程在这个地方完成。 分区的注意事项： 各工作区要有一定的隔离，操作器材专用，要有一定的方向性。如：标本制备→PCR扩增 →产物分析→产物处理。 样品的保存应该在上述三个区以外单独的区域。 各个区域的物品及衣服必须严格遵守单向的原则。 各个区域必须要自己单独的实验衣，实验时必须戴上手套。 每个区域要有自己单独的实验设备。 以下是常见的分区方式： PCR 扩 PCR 加样 样品制 PCR 扩增及杂交 样品制备及PCR 增及杂 区 备区 检测区 加样区 交检测