规模化猪场猪圆环病毒病检测方法.pdf

附 录 A （规范性附录） 检测方法 A.1 免疫荧光试验检测 PCV2 A.1.1 主要仪器、材料和试剂 荧光倒置显微镜、操净工作台、高速台式冷冻离心机和微量移液器（规格 0.5 μL~10 μ L 、20 μL~200 μL 、 100 μL~1 000 μL ）。 96孔细胞板、 1.5 mL 微量离心管和移液器配套的吸头等。 PK15细胞、 PCV2单克隆抗体、 PCV2 病毒液和荧光标记二抗（羊抗鼠 -FITC 、SPA-FITC 或抗猪 IgG-FITC ）。 A.1.2 操作方法 A.1.2.1 细胞制备 用含 10%小牛血清的 RMPI-1640 营养液培养 PK15细胞，长满单层后， 弃营养液，用 Hank’s液洗涤单层 2次~3次后，用 0.025% 胰酶消化，铺在 96孔板上， 37℃ 5%C 2 O 培养 36 h~48 h ，细胞长满单层。 A.1.2.2 接种样品 将细胞培养物接种 96孔细胞单层板上， 50 μL/孔， 37℃吸附 1 h，弃培 养液，加入维持液（含 2%血清的 RMPI-1640 营养液），50 μL/ 孔，同时，设 PCV2病毒液和 P 2 BS缓冲液的接种，分别作为阳性对照和阴性对照， 37℃ 5%CO 培养 36 h~48 h。弃培养液， 每孔加入浓度为 300 mmol/L 的 D- 氨基葡萄糖液 50 μL ，37℃培养 30 min ，弃去 D- 氨基葡萄 糖液换细胞维持液， 37℃继续培养 24 h~36 h 。 A.1.2.3 固定 弃维持液，用 PBS缓冲液（参见附录 B.1 ）洗涤细胞一次，充分晾干后，加 入 100 μL预冷的无水乙醇， 4 ℃固定 45 min ，用 PBS缓冲液洗涤 3次，每次 5 min 。 A.1.2.4 加 PCV2 抗体孵育 将抗 PCV2 单克隆抗体（或 PCV2 阳性猪血清）用 PBS缓冲液适 当稀释后，每孔加入 100 μL，37 ℃孵育 1 h 。 A.1.2.5 漂洗 用PBS洗涤 3次，每次 5 min 。 A.1.2.6 加荧光二抗孵育 将荧光二抗如羊抗鼠 -FITC 或 SPA-FITC ，用 PBS缓冲液 1:100稀 释后，每孔加入 50 μL， 37℃孵育 1 h A.1.2.7 漂洗 同A.1.2.5 。 A.1.2.8 观察 于荧光显微镜下，观察细胞形态及有无绿色荧光的细胞。 A.1.3 结果判定 细胞形态规则，且 PCV2 阳性对照孔内细胞核内含有大量特异性绿色荧光，而阴性对照 孔内无特异绿色荧光时，则试验成立。样品孔细胞核内有荧光着染，则判 PCV2检测阳性。 A.2 免疫组化法检测 PCV2抗原 A.2.1 主要仪器、材料和试剂 石蜡组织切片机、显微镜、微量移液器（规格 0.5 L~10μ μL 、20 μL~200 μL 、 100 μL~1 000 Lμ）。 病理组织染色缸、载玻片、盖玻片和移液器配套的吸头等。 4% 中性福尔马林、 4% 多聚甲醛、 3% H 2O2 甲醇溶液、 1.5%的牛血清白蛋白、二甲苯、 乙醇、石蜡、 PCV2 Cap 单克隆抗体、 PCV2 阳性对照血清和阴性对照血清、 HRP标记羊抗鼠 IgG （或HRP标记羊抗猪 IgG ）和苏木精染色液等。 A.2.2 操作方法 A.2.2.1 组织固定与修块