基因工程研究技术.pptx

基因工程研究技术Preparation, analysis and manipulation of nucleic acids and proteins所有的分子生物学技术都是基于对核酸和蛋白质性质研究的基础上发展的杂交： the base-pairing characteristics of DNA and RNAPCR： Thermophilic DNA polymeraseDNA克隆：DNA polymerase, restriction endonucleases and DNA ligase1. 核酸研究技术电泳分离：Separation by Electrophoresis 限制性内切酶切割：Cut by Restriction endonuclease杂交鉴定： Identification by HybridizationPCR扩增： Amplification by PCR DNA克隆和基因表达：DNA Cloning and gene expressionDNA文库的构建和目的基因的筛选（Construction of DNA library screening of target gene)基因组序列和分析：Genome sequence analysis1. 凝胶电泳是根据DNA和RNA的分子量大小、拓扑结构等性质进行分离一种分子被放置到电场中，它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率；电泳的迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。DNA、RNA由于其骨架中的磷酸基团呈离子化状态，带有负电荷，在电场中向正电极移动。线性DNA分子根据其分子量大小来分离。分子量大的DNA电泳速度比分子量小的DNA要慢。环状DNA的电泳速度与其拓扑结构相关。不同构型，相同大小分子量的DNA的电泳速度是：SC DNAL DNAOC DNAGel matrix (胶支持物)胶支持物是凝胶状的多孔物质，能允许DNA分子通过其内部的孔隙。琼脂糖（ Agarose）聚丙烯酰胺（ Polyacrylamide）溴化乙锭（ＥＢ）ＥＢ是具有扁平分子的核酸染料，能插入ＤＮＡ或者ＲＮＡ相邻碱基之间，在300nm波长的紫外线照射下发出荧光。当DNA和RNA用EB充分处理之后，其荧光强度与其分子量大小呈正比4 kb3 kb2 kb1 kb0.5 kb琼脂糖 (Agarose): 分离效果比聚丙烯酰胺差, 能够分离大分子DNA，分子量高达几十Kb聚丙稀酰胺 (Polyacrylamide): 分离能力高，能够分辨相差一个碱基或者一个碱基对的DNA或者RNA分子只能分离小分子量大样品 (1 to a few hundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲场电泳)DNA分子的迁移方向随电场方向的周期性变化而不断改变. 根据DNA地分子量大小、拓扑结构来分离样品.用来分离大分子的样品，分子量超过50Kb，甚至高达几M.Switching between two orientations: the larger the DNA is, the longer it takes to reorientRNA也可以用电泳方法分离RNA与DNA类似，带有负电荷；RNA是单链分子，很容易自发形成分子内的二级结构和三级结构，影响了电泳分离效果；用乙二醛处理RNA，阻止RNA的碱基配对，使得RNA与ＤＮＡ一样，电泳迁移率与分子量大小相关 2. 限制性内切酶在特定位点切割DNA分子识别位点粘性末端平末端同裂酶同尾酶？3. DNA杂交-确定特殊的DNA分子杂交（Hybridization):不同来源的单链DNA或者RNA通过碱基配对形成互补结构的过程探针-Probe探针：一段带有特殊标记的核苷酸序列，可以用来从混合的核苷酸中寻找含有与其序列互补的核苷酸序列。将要用探针杂交的混合核苷酸可以在电泳分离后的凝胶上，也可以在一个文库的不同的克隆中。探针在杂交之前需要进行标记，以便于在探针与目标序列杂交后能够被检测出。探针的标记Radioactive labeling: display and/or magnify the signals by radioactivity. Non-radioactive labeling: display and/or magnify the signals by antigen labeling: antibody binding – enzyme binding - substrate application (signal release)探针杂交可以确认电泳分离后的DNA和RNASouthern blot