细胞传代冻存复苏步骤.pdfVIP

准备工作： 1、进入细胞室前，首先用 75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌 30-50min ，过后，关闭紫外灯，通风 10min。 2、从冰箱中取出胰酶、 PBS缓冲液、培养基 注意事项： 1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。 2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。 3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。 开始工作： 1、实验前换衣帽，开风淋，吹风。 2、75%乙醇擦手，然后用 75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。 3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。 4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。 5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好 吸球。 6、用移液管加入适量的 PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞， 然后将 PBS 缓冲液弃掉。 7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约 2ml （所用胰酶的量），弃 掉枪头。 8、将细胞置于 5%CO2、37 度培养箱中 1min-2min ，目的：提高酶活 性，促进消化。 9、取待用细胞，取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上 烤一下，套好吸球。 10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底 粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。 11、离心 5min，1000 转/min 。 以下分别介绍： 一 换液 1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。 2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。 3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好 吸球。 4、用移液管加入适量的 PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞， 然后将 PBS 缓冲液弃掉。 5、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好 吸球。 6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。 7、将细胞置于 5%CO2、37 度培养箱培养。 二 传代 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液， 吸取已配制的培养基适量，加入离心管中，将细胞重悬、吹匀。 2、取 4-6 滴细胞悬液到新的培养瓶中，培养瓶中应先加好适量细胞 培养液，吹散细胞，镜下观察，细胞密度适宜则置入 5%CO2、37 度细 胞培养箱中。 三 冻存 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。 2、按胎牛血清： DMSO=9:1的比例配制冻存液，装入青霉素瓶中。 3、用移液管将冻存液平均加入离心管中， 混匀离心管中细胞冻存液。 4、用移液管将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口，标签。 5、冻存，需缓慢冻存，先放置 4 度冰箱 1 小时，然后放置 -20 度冰 箱 2 小时，再置于 -80 度冰箱过夜，最后置于液氮灌中保存。 四 种板 1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。 2、取培养瓶及小烧杯各一只，摆放好。 3、取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好 吸球。 4、先移取 2ml ，5ml，20ml 完全培养液 , 分别加入到离心管，培养瓶， 小烧杯中。 5、混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取适量细胞悬 2 液移入培养瓶，吹散细胞。镜下观察，细胞密度适宜则置入 5%CO、 37 度细胞培养箱中。（细胞传代目的） 6、取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，用微量 枪从小烧杯中取出细胞悬液（约 10 μl ），弃掉枪头，滴入盖玻片下 （不能有气泡，不然会影响细胞计数），镜下观察细胞数（每个象限 4 5 个细胞， 总和 20 个细胞， 5 ×10 个），不断调整小烧杯中细胞悬液 的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。 7、取 1 个 96 孔板