第9章蛋白质工程.pptxVIP

亲和标记是根据酶和底物的亲和性，修饰剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性，即试剂作用于被作用部位的某一基团,而不与被作用部位以外的同类基团发生作用。 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂。;亲和标记设计要满足两个条件： 亲和试剂必须含有能与某些氨基酸残基起 反应的化学基团 亲和试剂应当对活性部位专一性结合 蛋白质的正常配位体、底物和抑制剂的结构都可以作为设计亲和试剂的参考。;;光亲和试剂 是一类特殊的亲和试剂 它在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。 先与酶活性部位在暗条件下发生特异性结合，然后被光照激活后，产生一个活泼的功能基团，能与它们附近基团反应，形成一个共价的标记物。;5;;二、 在医药方面的应用;;3. 应用： 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） 消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 又如：用Dextran修饰?-淀粉酶，??－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。;;提高酶性能的方法： 1）从自然界筛选或诱导变异具有不同性质的突变体 不能保证在获得一种有利的突变时不会损害另一优良性能。 2）蛋白质化学修饰 不够专一，对分子内部的一些疏水氨基酸的侧链也无法予以修饰。 3）化学合成 对于分子量大于1万道尔顿的蛋白质，从经济和技术上不能满足工业用酶或蛋白质的要求。 ;;一、蛋白质工程概念： 根据蛋白质的结构规律及其功能的关系，对蛋白质进行改造，以生产出性能更加优良的新型酶分子。 是以创造性能更适用的蛋白质分子为目的，以结构生物学与生物信息学为基础，以基因重组技术为主要手段，对天然蛋白质分子的设计和改造。 ;基因工程与蛋白质工程： ;;;;二、蛋白质的功能基础 蛋白质的功能在很大程度上取决于其空间结构。 蛋白质的空间结构依赖于其所含的氨基酸序列, 而氨基酸的序列又由其编码基因的核苷酸序列所决定。 因此按预定方案通过对编码该蛋白质基因的改造应用基因工程技术就可以获得新型的???白质分子。;蛋白质结构测定 一级结构测定： 直接法：直接测定多肽链的氨基酸顺序。 间接法：从编码蛋白质的基因的核苷酸顺序来推导蛋白质的氨基酸顺序。 三级结构测定： X-射线晶体衍射——研究处在晶体状态下的蛋白质的空间结构 核磁共振(NMR)光谱——研究处在溶液状态的蛋白质的结构。 ; X-射线衍射技术： 用于蛋白质及核酸三维结构的确定，至今已有数百种蛋白质的结构被确定。;三、蛋白质工程的主要手段 蛋白质工程的长远目标是创造人类所需要的各种性能优越的人造蛋白质。但目前主要是通过基因突变手段以制取天然蛋白质的各种人工突变产物。 以重组DNA技术为核心的基因工程技术改造蛋白质。 位点特异性突变—基于结构生物学、信息生物学 基因突变 随机突变——基于高通量筛选法 基因内部的剪接 基因剪接 5‘或3’端的剪接;定点诱变 (site-directed mutagenesis) 在体外使DNA分子内部的特异部位发生突变的过程。 最常用的方法是合成一条序列有变异的寡核苷酸，使其与靶DNA分子杂交/退火，再合成完整的DNA。 ;;产生随机突变的方法： 化学诱变，错掺诱变，盒式诱变。 高通量筛选法：从巨大数目的突变体库中筛选到具有期望功能的突变体。 筛选方法：表型观察筛选，当筛选的蛋白可以产生可见信号时，用简单的表型观察和筛选被广泛应用。 目前，蛋白质突变体库筛选一般是固态（琼脂糖和滤膜）或者液态（微量滴定孔板）条件下通过表型选择和筛选而完成的。 高通量筛选蛋白质突变体库的方法：噬菌体展示技术（phage display) 。　;适用范围：抗原表位分析、分子间相互识别、新型疫苗及药物的开发研究方面;;;基因内部剪接 在编码基因的内部插入或剪去特定的序列、结构原件或结构域。 5’或3’端的剪接 融合基因可以用于在体外产生不同基因或基因片段之间的融合，产生融合蛋白。 避免目的蛋白在表达时被降解 增加分泌性（信号肽） 提高溶解性（硫氧化还原蛋白）;重组酶的高效表达 一、细菌表达体系 二、酵母系统中的表达 三、丝状真菌中的表达;1.用大肠杆菌表达 体系生产重组酶;大肠杆菌表达载体必备元件：; ;??;;;;;;;;;;;;第三节 蛋白质工程成果及应用 ; 研究表明该酶与其底物之间能形成11对氢键,其中8对氢键的形成来源于酶的氨基酸侧链。 1989年,Eersht等人应用蛋白质工程技术对这8个