PEDV S蛋白COE区特异性抗原表位蛋白克隆表达及其免疫原性分析.pdfVIP

目录 目 录 摘要 III Abstract IV 第一章 文献综述 7 1.1 PED 概述 7 1.2 PEDV 症状及病理变化 11 1.3 PEDV 流行病学 12 1.4 预防方法 14 1.5 诊断 15 1.6 研究进展 15 1.7 研究的目的与意义 17 第二章 PEDV S 蛋白 COE 基因片段的克隆与原核表达 18 2.1 前言 18 2.2 试验材料 18 2.3 RNA 提取反转录 PCR 试验方法23 2.4 PSC-pMD-18T 载体构建 25 2.5 PSC-PET32 原核表达载体构建 28 2.6 BL21 表达菌表达目的蛋白与纯化 31 2.7 目的蛋白PSC 的pMal c2x 原核表达载体构建 33 2.8 pMal c2x 重组抗原蛋白的表达纯化 34 2.9 诱导蛋白的 SDS电泳 35 2. 10 Western blot 检测表达蛋白 36 2.11 目的片段克隆及表达载体构建结果 37 2.12 PSC 目的基因的生物信息学分析结果 39 2.13 PSC-PET-32 表达载体构建结果42 2.14 pMal-c2x-PSC 表达载体构建结果44 2.15 诱导蛋白的 SDS电泳结果 45 2.16 Western blot 检测表达蛋白结果46 i 目录 第三章 免疫原性分析46 3.1 前言46 3.2 试验材料46 3.3 试验动物47 3.4 试验小鼠分组及免疫47 3.5 免疫小鼠血清 IFN- γ测定47 3.6 免疫小鼠血清 IL-2 和 IL4 测定48 3.7 淋巴细胞增殖试验48 3.8 目的蛋白ELISA 检测敏感性试验49 3.9 结果 50 讨论 54 结论 56 参考文献 58 附录 71 致谢 72 ii 摘要 摘 要 到目前为止，猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV ）在世界各国 之间流行，给各国的生猪业带来了难以估计的经济亏损。PEDV 对环境的耐受力强、传播 途径广泛使其成为生猪业的难以预防的传染性疾病。目前，国内外针对PEDV 进行了深度 的研究，主要针对其特异性诊断和相关疫苗的研究。COE 区是PEDV S 蛋白中一段部分保 护性抗原基因，本研究旨在获得 PEDV S 蛋白的 COE 区的强特异性抗原性的蛋白，并以此 为基础为后续建立特异性 ELISA 检测方法奠定基础。 根据已报道的 PEDV S 蛋白的 COE 区的抗原表位序列，设计引物，从患有PED 死亡 的仔猪肠道组织、淋巴结组织提取病毒 RNA ，提取病毒目的 RNA 、并反转录获取 cDNA, 通过 PCR 获取目的基因序列。并将目的基因连接入 pMD-18T 载体。测序鉴定目的基因， 测序结果证明基因序列正确。通过生物学信息学分析，该基因编码的蛋白质含有 6 个含有 潜在 T 淋巴细胞抗原决