总RNA提取试剂盒操作流程.docVIP

总RNA提取试剂盒操作流程 试剂配制：DNA酶1：将550ul无核酶水加入DNA酶1瓶中，分装32瓶，每瓶17.1ul,可用3次。注意，轻轻混匀，不要震荡。置于-20度保存，避免反复冻融，不宜超过3次以上。RNA裂解液：将1-硫代甘油按2%（V/V）加入RNA 裂解液中，可在4度保存6个月。RNA洗液：将70ml无水乙醇加入到40mlRNA洗液中。 步骤： 贴壁细胞裂解物的制备。胰酶消化离心后得细胞悬浮液，取1.5*103 -5*106 细胞，离心后收集细胞沉淀。（不同样品最适起始用量和裂解液、稀释液的使用量。悬浮或贴壁细胞1.5*103-5*106使用量，裂解液300ul,稀释液300ul。） 加入300ul的RNA裂解液，吹打混匀，移至1.5mlEP管中 二RNA提取 加入300ul的RNA稀释液，用移液枪混匀，室温放置3-5分钟，（如果样品比较珍贵，可以选择裂解物加入稀释液后70℃下加热3分钟，可以提高RNA的得率） 以最大速度离心5分钟，吸取上清液置于另一1.5mlEP管中 加入0.5倍上层清液体积的无水乙醇，移液器吹打3-4次，混匀， 取出离心柱/细心管（离心柱已安放在收集管上），将混合物移至离心柱中，如果混合物体积过大，可分2次上样过柱。12000-14000*g离心1分钟，弃掉滤液 加入600ulRNA洗液，12000-14000*g离心45秒，弃掉滤液 配置DNA酶1孵育液，DNA酶1缓冲液5ul+dna酶1 液5ul+无核酶水40ul.注意轻轻混匀，不要震荡。（这是提取一管RNA需要的量） 加入50ulDNA酶1孵育液到吸附膜中央，室温放置15分钟 加入600ulRNA 洗液，12000-14000*g离心45秒，弃掉滤液。将离心柱重新安置于收集管上，12000-14000*g离心2分钟 将离心柱转移到洗脱管上，在离心柱膜中央加入50-200ul无核酶水，室温下静置2分钟，12000-14000*g离心1分钟。将RNA保存在-70℃。 温馨提示，如果将第一次洗脱下来的洗脱液重新加回到离心柱中央，室温下静置2分钟，12000-14000*g离心1分钟，再次洗脱RNA，可以提高RNA的得率。 注意事项：避免DNA污染，样品起始量不宜过多。质量较好的A260/A280值应该在1.9-2.1之间。