尼罗罗非鱼Akirin基因的抗菌性能及其多克隆抗体的制备研究.pdfVIP

符号说明 Ah : Aeromonas hydrophila ，嗜水气单胞菌 Et: Edwardsiella tarda ，迟钝爱德华氏菌 Se: Staphylococcus epidermidis ，表皮葡萄球菌 IL-1: Interleukin-1，白细胞介素-1 IL-8: Interleukin-8，白细胞介素-8 IL-12: Interleukin-12，白细胞介素-12 TNF: Tumor necrosis factor alpha ，肿瘤坏死因子α IFN: Interferon ，干扰素 AMP: Ampicillin ，氨苄青霉素 CDS: Coding Sequence ，编码序列 cDNA: Complementary DNA ，互补脱氧核糖核苷酸 kD : kilodalton ，千道尔顿 ORF: Open Reading Frame ，开放阅读框 PAGE: polyacrylamine Gel Electrophoresis ，聚丙烯酰胺凝胶电泳 PCR: Polymerase Chain Reaction ，多聚酶链式反应 ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ，酶联免疫吸附试验 qRT-PCR : Quantitative Real Time-PCR ，实时荧光定量PCR Rpm: Revolutions Per Minute ，每分钟转数 RNA: Ribonucleic Acid ，核糖核酸 TAE: Tris-Acetic acid-EDTA ，三羟基甲基氨基甲烷- 乙酸- 乙二胺四乙酸 Μg : microgram ，微克 WB: Western-blot ，蛋白质免疫印迹 IPTG: isopropylthio β-galactosidase ，异丙基硫代β-半乳糖苷 目 录 中文摘要 I Abstract III 1 前言1 1.1 尼罗罗非鱼及其养殖现状1 1.2 嗜水气单胞菌的研究进展1 1.3 迟钝爱德华氏菌的研究进展2 1.4 表皮葡萄球菌的研究进展3 1.5 鱼类的免疫系统4 1.6 Akirin 基因的研究进展5 1.7 鱼类细胞免疫因子的研究进展6 1.7.1 鱼类白细胞介素的研究进展7 1.7.2 鱼类肿瘤坏死因子的研究进展8 1.7.3 鱼类干扰素的研究进展8 1.7.4 鱼类Caspase 的研究进展9 1.8 目的意义9 2 材料与方法10 2.1 试验材料10 2.1.1 样品采集10 2.1.2 试验耗材11 2.1.3 试验仪器11 2.1.4 试验试剂及来源12 2.1.5 试验所用引物12 2. 1.6 主要数据库及软件13 2.2 试验方法14 2.2.1 人工感染尼罗罗非鱼试验14 2.2.2 总RNA 的提取14 2.2.3 RNA 检测15 2.2.4 qRT-PCR 检测病原菌感染后Akirin 的表达量16 2.2.5 尼罗罗非鱼Akirin 基因CDS 区的扩增16 2.2.6 PCR 产物胶回收17 2.2.7 PCR 产物与载体的连接17 2.2.8 大肠杆菌的转化及测序17 2.2.9 重组质粒的构建18 2.2. 10 原核表达及纯化20 2.2.11 抗血清制备23 2.2.12 ELISA 检测血清抗体的免疫效价23 2.2.13 Western blot 检测抗血清的特异性23 2.2.14 qRT-PCR 检测免疫相关基因的表达24 2.2.15 个体水平上检测蛋白对病原菌侵染罗非鱼的影响25 3 结果与分析25 3.1 病原菌处理后尼罗罗非鱼Akirin1 基因mRNA 表达分析25 3.2 病原菌处理后尼罗罗非鱼Akirin2-1 基因mRNA 表达分析26 3.3 病原菌处理后尼罗罗非鱼Akirin2-2 基因mRNA 表达分析28 3.4 多克隆抗体的制备29 3.4.1 尼罗罗非鱼Akirin1,Akirin2 -1,Akirin2-2 基因CDS 区的扩增29 3.4.2 重组质粒的构建29 3.4.3 原核表达31 3.4.4 蛋白纯化32 3.4.5 ELISA 检测抗血清效价32 3.4.6 W