生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理步骤试剂配制结果分析分析.ppt

DNA 琼脂糖凝胶电泳 实验原理 ? 琼脂糖为链状多糖 → 绳状琼脂糖束 → 大网孔型凝 胶 —— 分离、鉴定、纯化 DNA ? 在 pH 值为 8.0 ～ 8.3 时，核酸分子碱基几乎不解 离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。 ? 采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分 子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分 子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。 实验原理 ? 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶 (Ethidium bromide, EB) 染色 , 在紫外光下至少可以检出 1- 10ng 的 DNA 条带 , 从而可以确定 DNA 片段在凝胶 中的位置。 ? 此外 , 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA 条带 , 用于以后的克隆操作。 ? 该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如 密度梯度离心法）所无法分离的 DNA 片段。 影响 DNA 迁移率的因素 ? 影响 DNA 迁移率的因素： DNA 分子的大小、构 象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等 ? 缓冲液 pHDNA pI ， DNA 带负电荷，迁移率与 分子量对数成反比 ? DNA 分子构象影响迁移率：共价闭环 DNA 线 状 DNA 开环 DNA ? DNA 片段越长，泳动速度越慢 ? 在低电压时， 泳动速度与电场强度成正比 不同浓度琼脂糖分离 DNA 分子的范围 琼脂糖浓度（ W/V,% ） 分离范围（ kb ） 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA 电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。 ? 嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线 状和带缺口的环状 DNA ，使其刚性更强 , 还会使 线状 DNA 迁移率降低 15 ％。 ? 离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响 DNA 的 电泳迁移率。在无离子存在时 ( 如误用蒸馏水配制 凝胶 ), 电导率最小 , DNA 几乎不移动 ; 在高离子强 度的缓冲液中 ( 如误加 10 ×电泳缓冲液 ), 则电导很 高并明显产热 , 严重时会引起凝胶熔化或 DNA 变性。 琼脂糖凝胶中 DNA 的观察 溴化乙锭（ EB ） — DNA ：紫外光下 桔红色荧光 主要实验器材 电泳仪 电泳槽 缓冲液 琼脂糖 凝胶槽 梳子 取液器 溴酚蓝 电泳槽结构 缓冲溶液配制表 电泳指示剂 ? 核酸电泳常用的指 示剂有两种 : 溴酚蓝 (bromophenol blue, Bb ) 呈蓝紫色；二甲 苯腈 ( xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携 带的电荷量比溴酚 蓝少，在凝胶中的 迁移率比溴酚蓝慢。 胶浓（ % ） 溴酚蓝 二甲苯腈 0.6 1kb 1 0.6kb 2kb 1.4 0.2kb 1.6kb 2 0.15kb 操作步骤 ? 琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却， EB ? 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 ? 样品的制备：样品 +1/5 体积溴酚蓝 ? 加样：加样端为负极（黑） ? 电泳： 5V/cm ? 观察：紫外灯下观察，照相 溶 胶 准备胶槽 凝胶冷却至 50 ° C ，加 EB 至终浓度 0.5 μg/ml 铺 胶 凝胶凝固后取出梳子 加电泳缓冲液 准备样品