X17-2020犬星状病毒RT-PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 团 体 标 准 T/CVMA X17—2020 犬星状病毒RT-PCR 检测方法 Detection of canine astrovirus by RT-PCR method 中国兽医协会 发 布 T/CVMA X17—2020 前 言 本标准按照GB/T 1.1 2020 给出的规则起草。 1 T/CVMA X17—2020 犬星状病毒RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了犬星状病毒RT-PCR检测方法的缩略语、材料、操作步骤和结果判定。 本标准适用于犬的星状病毒的实验室诊断。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcrition-polymerase chain reation）。 RNA：核糖核酸（Ribonucleic acid）。 DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyriboNucleic acid）。 cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementary DNA）。 PBS：磷酸缓冲盐溶液 （phosphate buffer saline） 4 材料 4.1 仪器设备 4.1.1 -20℃冰箱 4.1.2 高压蒸汽灭菌器 4.1.3 干热箱 4.1.4 恒温水浴锅 4.1.5 分析天平，感量0.1mg 4.1.6 高速冷冻离心机，12 000r/min 以上 4.1.7 旋涡振荡器、 4.1.8 PCR 扩增仪 4.1.9 核酸电泳仪 4.1.10 凝胶成像系统 4.2 耗材与器械 4.2.1 1.5mL 离心管。 4.2.2 医用棉签 2 T/CVMA X17—2020 4.2.3 0.22µm 过滤器。 4.2.4 枪头，10µL，200µL，1 000µL。 4.2.5 移液器，0.1-2.5µL, 0.5-10µL, 1-100µL, 100-1000µL。 4.3 试剂 4.3.1 RNA 提取试剂盒。 4.3.2 反转录试剂盒。 4.3.3 Taq DNA 聚合酶。 4.3.4 灭菌双蒸水，实验用水应符合GB/T 6682 中一级水的要求。 4.3.5 PBS 缓冲液 （pH7.4，含青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL）。 4.3.6 琼脂糖 （分析纯）。 4.3.7 DNA 电泳缓冲液。 4.3.8 Goldview 核酸染料。 4.4 引物 4.4.1 试验中所用引物见表1。 表1 引物序列和片段大小 引物名称 引物序列5--3 片段大小 CaAstV-F GAGTTTGATTGGACCAGATTTGA 419bp CaAstV-R GGCTTAACCCACATTCCAAA 5 操作步骤 5.1 采样器具前处理 5.1