2014微生物限度检查实验.docVIP

微生物限度检查 检验任务:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、沙门菌的检测 一、实验目的 1.熟悉药品中金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的检验原理。 2.熟悉检验金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌的程序与方法。 二、实验材料 1、培养基和稀释液：亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）、卵黄高盐琼脂（或血平板或TMP高盐琼脂）、营养琼脂斜面培养基、甘露醇发酵管、胆盐乳糖增菌液、十六烷三甲基溴化铵培养基、绿脓色素测定用培养基（PDP琼脂）、硝酸盐胨水平板（DHL）、明胶液化培养基，营养琼脂培养基、四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）、胆盐硫乳琼脂、沙门、志贺菌属培养基（SS）、曙红亚甲蓝琼脂（EMB）、麦康凯琼脂（MacC）、三糖铁琼脂培养（TSI培养基）、脲琼脂培养基、半固体营养琼脂培养基、0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液。 2、器皿 灭菌锥形瓶（50ml）、灭菌培养皿、刻度吸管 试剂（已配好）：1%二甲基对苯二胺盐试液、氯仿、IN盐酸、NS 第一次 培养基的配制 1.培养基及稀释液： 0.9%无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液 配方：氯化钠4.3g 蛋白胨1.0g 磷酸二氢钾3.5g 磷酸氢二钾7.23g 水1000ml 亚碲酸钠肉汤：90ml/瓶*3瓶 卵黄高盐琼脂培养基（或TMB培养基或血琼脂平板）：3个*20ml/个 营养琼脂斜面：3个平皿*约20ml/个 甘露醇发酵管：3支*5ml/支 TYB増菌液：90ml/瓶*3 胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）：20ml/个*3个 麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基）：20ml/个*3 三糖铁琼脂斜面培养基：5ml/支*3支 脲琼脂培养基斜面：5ml/支*3支 半固体营养琼脂培养基：5ml/支*3支 胆盐乳糖增菌液（BL増菌液）：90ml/瓶*3瓶 十六烷三甲基溴化铵平板：6个*20ml/个 PDP琼脂斜面：3支*5ml/支 硝酸盐胨水培养基：3支*5ml/支 明胶培养基：5ml/支*3支 第二次 供试液及増菌液的制备 供试液的制备 取供试液10ml，加入Ph7.0无菌氯化钠溶液-蛋白胨缓冲液90ml，混匀，制成1：10供试液。 稀释倾注培养基 将供试液倾注入已加稀释液的无菌平板，每个稀释度注2个平皿，每个平皿约15-20ml，将供试液和培养基混匀，放置，待凝。 取亚碲酸钠肉汤（或亚碲酸钠北沙参胨水培养基）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37℃环境下培养24-48h。 取四六磺酸钠绿亮培养基（TYB増菌液）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于 ℃环境下培养 取胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂）3份，每份100ml，分别加入10ml供试液，10ml供试液及0.2ml对照菌液做阳性对照，与加入供试液等量的稀释剂作阴性对照。置于37℃环境下培养18-24h 第三次 分离培养 将上述各种供试品培养液轻轻摇动，以接种环沾取1~2环培养液划线至下类各种培养基 培养基种类 细菌种类 卵黄高盐琼脂培养基（或TMB培养基或血琼脂平板） 金黄色葡萄球菌 十六烷三甲基溴化铵平板 绿脓杆菌 胆盐硫乳琼脂培养基（或沙门氏、志贺菌属琼脂） 沙门氏菌 麦康凯琼脂培养基（或曙红亚甲蓝琼脂培养基） 沙门氏菌 置于37℃，培养18~24h 第四次 金黄色葡萄球菌： 取金黄色葡萄球菌纯培养物，接种于甘露醇发酵管中，置于37`C培养18~24h。【金黄色葡萄球菌发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）】。 绿脓杆菌： 绿脓色素试验与硝酸盐还原试验 挑取分离的纯培养物分别接种于PDP琼脂斜面，硝酸盐胨水培养基中，置37℃培养24h。 明胶液化试验 用接种针取疑似绿脓杆菌菌落，穿刺接种于明胶培养基内，置37℃培养24h。 42℃生长试验 挑取纯培养物，接种在营养琼脂斜面培养基上，置42℃水浴中培养24～48h， 沙门氏菌： 脲酶试验：取菌种接种于脲琼脂培养基斜面，置于37℃培养18～24h 动力试验：穿刺接种于半固体营养琼脂培养基，置于37℃培养18～24h 第五次 生化实验和镜检、表格填写 1.生化实验 金黄色葡萄球菌： （1）.甘露醇发酵试验 若发酵甘露醇产酸使培养基变成黄色（溴麝香草酚蓝在酸性条件下呈黄色）。则证明有金黄色葡萄球菌 （2）.血浆凝固酶试验 ①.玻片法 取一洁净干燥的载玻片在两边分别滴加NS和血浆各一滴，用接种环取待检菌分别在NS和血浆滴中充分研磨混合，观察反应现象。凡在5min内混箘的血浆出现团块或颗粒状凝块，为血浆凝固酶试验阳性