普通生物学试验实验4微生物的紫外诱变.ppt

实验四微生物的紫外诱变 一、目的要求 掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理。 掌握选育高产突变型菌株的方法。 二、基本原理 紫外线是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对，从而引起突变。 紫外线照射引起的DNA损伤，可由光复活酶的作用进行修复，使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。 为了避免光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应在红光下进行，并将照射处理后的微生物放在暗处培养。 三、实验器材 菌株 枯草芽孢杆菌 培养基 淀粉培养基 溶液或试剂 碘液，无菌生理盐水，盛4.5ml无菌水试管 仪器或其他用具 1ml无菌吸管，玻璃涂布棒，血细胞计数板，显微镜，紫外灯（15W），磁力搅拌器，台式离心机，振荡混合器等。 四、操作步骤 制备菌悬液 取枯草芽孢杆菌48h斜面培养物4-5支→用10ml无菌生理盐水洗下菌苔→倒入无菌大试管→振荡30s，打散菌块→3000r/min离心10min→弃上清液→用无菌生理盐水洗涤菌体2-3次→制成菌悬液→用显微镜直接计数法调整细胞浓度108个/ml。（老师完成） 制作淀粉琼脂培养基平板 紫外线处理 打开紫外灯预热20min。 各取3ml菌悬液，分别加入2套6cm无菌平皿中，并放入一根无菌磁力棒。 将平皿置于磁力搅拌器上，打开皿盖，在距离30cm，15W的紫外灯下分别搅拌照射1min和3min。盖上皿盖，关闭紫外灯。 稀释：把照射过的菌悬液用无菌水稀释成10-1-10-6； 涂平板：取 10-4、10-5、10-6稀释液和未经照射的稀释液（对照）各0.1ml涂平板，重复三个平板； 培养：用黑布或纸包好，37℃培养24h。 观察诱变效应 选取cfu数在5-6个左右的处理后涂布的平板观察诱变效应。 分别向平板内加碘液数滴，在菌落周围出现透明圈。 分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC比值）。 选取HC比值大的菌落转接到试管斜面上培养，可用于复筛。 五、注意事项 紫外线照射计时从开盖起，加盖止； 先开磁力搅拌器，再开盖照射，使菌悬液中的细胞接受均等照射； 从紫外线照射处理开始，直到涂布完平板的所有操作步骤都需在红光下进行。 分别计算紫外线处理1min和3min后的存活率和致死率 存活率（%）= 致死率（%）= 稀释倍数 菌落数 处理时间/min 10-4 10-5 10-6 各皿菌落数 平均值 各皿菌落数 平均值 各皿菌落数 平均值 0min 1min 3min 计算各皿菌落数，填入表-1。 表-2 CFU的计算，计算方法参照微生物实验课本207-208页 处理时间/min 稀释液及各皿菌落平均数 两稀释液之比 菌落总数 cfu/mL 备注 10-4 10-5 10-6 0min 两位以后的数字 采取四舍五入的方法填写 1min 3min 稀释倍数 CFU 处理时间/min １０－４ １０－５ １０－６ 存活率/% 致死率/% 0（对照） １min ３ min 观察诱变效应，计算存活率、致死率、HC比值，填入表-3。 HC比值 菌落１ 菌落２ 菌落３ ……… ………… 0（对照） １min ３ min 观察诱变效应，计算存活率、致死率、HC比值，填入表-3。 七、思考题 Ｐ１３１２.(2)、(3)①②。 　用紫外线进行诱变时，为什么要打开皿盖？为什么要在红光下操作，暗环境下培养？ 　分析你的实验结果： 　　①是否获得了比对照组产淀粉酶更高的突变株？试分析其可能的原因。 　　②从你的实验结果中，说明致死率与诱变效应的相关性。