3H-TdR掺入法检测淋巴细胞转化率.docVIP

3H-TdR掺入法检测淋巴细胞转化率 —液体闪烁滤膜测量法 【目的】 1.掌握示踪法的原理及其在机体免疫功能检测上的应用。 2.初步掌握液认计数滤膜测量的基本技术。 【原理】 胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA合成的前身物。人外周血T淋巴细胞在PHA刺激下发生母细胞转化而增殖，处于S期的细胞不断地摄取TdR用以合成DNA。与此同时，3H-TdR也不断地被摄入细胞内而被放射性标记。通过液体闪烁计数测量方法，便可了解淋巴细胞增殖活动的情况，籍以了解机体的细胞免疫功能。 【材料和方法】 1、主要材料： 消毒肝素抗凝管（内含肝素10～20单位）、注射器、微量加样器、微量细胞培养板、49型玻璃纤维滤膜、离心机、细胞培养箱、干燥箱、多头细胞收集器，FJ-2107液体闪烁计数仪。 2、主要试剂 完全RPMI-1640培养液（内含15% FCS，25 mM Hepes，5×10-2 mM=巯基乙醇），植物血凝素（PHA，用完全RPMI—1640配成浓度为30 ug/ml）；3H-TdR工作液18.5KBq/20 ul（中国原子能研究院同位素所）。闪烁液（二甲苯1000 ml,ppo 7 g,popop 0.5 g）。 3、主要步骤 ①静脉采血肝素抗凝，充分摇匀后加入细胞微量培养板内（ 20 ul/孔）。每个样品设自发转化孔和分裂原刺激孔，均为三个复孔。 ②自发转化孔每孔内加完全RPMI 1640液 0.2 ml，分裂原刺激孔每孔内加PHA液0.1 ml, RPMI 1640液0.1 ml。加样后，轻轻震荡混匀，置37℃ CO2培养箱内培养。 ③细胞培养至56 h，每孔内加入3H-TdR工作液各20 ul。轻轻震荡混匀后置37℃,CO2培养箱内继续培养至72 h终止培养。 ④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收集在49型玻璃纤维滤膜上，将滤膜置烤箱内烘干。 ⑤滤膜冷却后移入存有5 ml闪烁液的闪烁杯中，避光放置一段时间后，用FJ-2107液闪计数器测量放射性，结果用刺激指数（SI）表示。 刺激指数（SI）= 实验概要 熟悉混合淋巴细胞培养(mixed lymphocyte cultue，MLC)的原理；掌握分离淋巴细胞的方法；学习用同位素标记进行混合淋巴细胞培养的操作方法。 实验原理 混合淋巴细胞培养或称混合淋巴细胞反应（MLR）是将二个无关个体的淋巴细胞混合在一起培养，由于二者的淋巴细胞膜上的组织相容性抗原不同，可互相刺激，导致对方的淋巴细胞分裂增殖和转化。转化的淋巴母细胞表现为细胞体积增大，核内DNA和胞浆内RNA合成增加等。可通过形态学方法计数转化的淋巴细胞百分数，也可通过测定激活的淋巴细胞摄取DNA合成的前体-3H标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入量的多少来判定。同位素标记法较为客观，重复性好且结果较准确。其增殖反应强度与双方组织相容性抗原的差异程度成正比。两者相容性愈差，反应愈强烈。 本法有双向和单向MLC之分，在双向MLC中，双方的淋巴细胞互相刺激而增生、转化，即双方的淋巴细胞既是刺激细胞，又是反应细胞；在单向MLC中，将一方的淋巴细胞用X线照射或用丝裂霉素C处理，使其丧失增殖反应能力而仍保留其抗原刺激效应，此时的MLC只有一方淋巴细胞发生增殖反应，故可了解不同个体淋巴细胞刺激强度与增殖反应强度。 主要试剂 1. RPMI 1640培养液（100mL）：内含经56℃ 2. 丝裂霉索C（mitomycin C）：用双蒸水配成400μg/mL溶液； 3. 3H-TdR：用生理盐水稀释为500μg/mL，4℃ 4. 闪烁液、生理盐水。 主要设备 1. 离心管 2. 滴管 3. 微量加样器 4. 试管架 5. 同位素微量加样器 6. 同位素测量杯 7. 49型玻璃纤维滤片 8. 超净工作台 9. 细胞培养板 10. CO2培养箱 11. 离心机 12. 细胞收集仪 13. β液闪烁计数仪等 实验材料 人外周血淋巴细胞：取两个不同个体A和B的肝素抗凝外周血，用淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。洗涤后用RPMI 1640培养液调整细胞浓度为1×106/mL。 实验步骤 1. 将A、B二个体的淋巴细胞悬液分别做记号，以个体A的作为MLC的反应细胞，个体B的作为MLC的刺激细胞，记作Bm； 2. 刺激细胞处理：取个体B的淋巴细胞悬液0.9mL，加人400μg/mL的丝裂霉素C 0.1mL，使其终浓度为40μg/mL细胞悬液，置37℃水浴30min，离心弃上清，沉淀细胞用培养液洗一次，调整细胞浓度至1× 3. 用微量加样器各取0.1mL反应细胞（A）和刺激细胞（Bm）于一圆底细胞培养板的孔中（A Bm），同时，设自身对照组AA或BBm和空白对照组。置37℃ 4. 在培养终止前15～16h，用同位素微量加样器于每孔内加入3H-TdR 1μL（含0.5