回顾Western blot 实验原理和实验步骤.pptVIP

Western Blot一般流程 1 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色 * 蛋白样品的制备 2 1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。 2、分泌蛋白的提取：取15ul细胞上清，加入5ul 5Xloading buffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。 * 3 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 4 分离胶浓度与蛋白分离范围 * 5 制胶 1）装好架子，固定好玻璃板。 2）注水试漏。 3）倒水，甩干，用滤纸吸净残留水份。4)按照下面配方配制12%分离胶。一般1.5玻璃板需胶6.5-7ml，1.0玻璃板需胶4.5ml。 5)将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。 6）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气泡压出、将胶面压平并防止顶层胶风干。 7)待分离胶凝集后（至少20度，30min），配制浓缩胶5％。 * 6  制胶过程注意事项 操作时要使两玻璃对其，以免漏胶 加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。 灌胶时开始可快一些，胶面快