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实验六、植物组织丙二醛含量测定 植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白 质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这 些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物 在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内活性氧代谢的平衡被破坏而有利于 活性氧的积累。活性氧积累的危害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用， 造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。活性氧包括含 氧自由基。自由基是具有未配对价电子的原子或原子团。生物体内产 生的活性氧主要有超氧自由基 (O-2) 、羟自由基 (OH·) 、过氧自由基 (ROO·) 、烷氧自由基 (RO·) 、过氧化氢 （H2O2）、单线态氧 （O21）等。 植物对活性氧产生有酶促和非酶促两类防御系统，超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 、过氧化物酶 POD和抗坏血酸过氧化物酶 (ASA— POD)等是酶促防御系统的重要保护酶， 抗坏血酸 (ASA)和还原型 谷胱甘肽 (GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂。 丙二醛 (MDA)是细胞膜脂过氧化作用的产物之一， 它的产生还能加 剧膜的损伤。因此，丙二醛产生数量的多少能够代表膜脂过氧化的程 度，也可间接反映植物组织的抗氧化能力的强弱。所以在植物衰老生 理和抗性生理研究中，丙二醛含量是一个常用指标。 [ 原理 ] 植物组织中的丙二醛 (MDA) 在酸性条件下加热可与硫代巴比妥酸 (TBA) 产生显色反应， 反应产物为粉红色的 3 ，5 ，5 一三甲基恶唑 2， 4 一二酮 (Trimet — nine) 。该物质在 539nm波长下有吸收峰。由于硫 代巴比妥酸也可与其它物质反应，并在该波长处有吸收，为消除硫代 巴比妥酸与其它物质反应的影响，在丙二醛含量测定时，同时测定 600nm下的吸光度，利用 539nm与 600nm下的吸光度的差值计算丙二 醛的含量。 [ 材料、仪器、药品 ] 1 ．材料：植物抗逆性鉴定实验中的四种菠菜样品， 即绿色和黄色 叶片的高温处理和室温对照。 2 ．仪器：(1) 分光光度计； (2) 离心机；（3）水浴锅：(4) 天平； (5) 研钵； (6) 剪刀； (7) 5ml 刻度离心管； (9) 刻度试管 (10ml) ； (10) 镊子； (11) 移液管 (5ml 、2ml、1ml) ；（12）冰箱。 3．药品： (1) 0.05mol/L pH7.8 磷酸钠缓冲液； (2) 石英砂； (3) 5％三氯乙酸溶液：称取 5g 三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解， 然后定容到 100ml； (4) 0.5 ％硫代巴比妥酸溶液：称取 0.5g 硫代巴比妥酸，用 5％ 三氯乙酸溶解， 定容至 100ml，即为 0.5 ％硫代巴比妥酸的 5％三氯乙 酸溶液。 [ 方法 ] 1．丙二醛的提取：取 0.5g 样品，加入 2ml 预冷的 0.05mol/L pH7.8 的磷酸缓冲液，加入少量石英砂，在经过冰浴的研钵内研磨成匀浆， 转移到 5ml 刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗也移入离心管 中，最后用缓冲液定容至 5ml。在 4500 转/min 离心 10min。上清液即 为丙二醛提取液。 2 ．丙二醛含量测定：吸取 2 ml 的提取液于刻度试管中， 加入 0.5 ％ 硫代巴比妥酸的 5%三氯乙酸溶液 3ml ，于沸水浴上加热 10min，迅速 冷却。于 4500 转/min 离心 10min。取上清液于 532、600nm波长下， 以蒸馏水为空白调透光率 100%，测定吸光度。