实验二HPLC法测定咖啡因地含量.pdfVIP

实验二 高效液相色谱法测定咖啡因的含量 一、实验目的 1．熟悉高效液相色谱仪的基本结构和操作方法。 2 ．熟悉高效液相色谱的定量方法（标准曲线法） 。 二、实验原理 液相色谱法就是同一时刻进入色谱柱中的各组分， 由于在流动相和固定相之 间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在 3 6 两相间进行反复多次（ 10 ～10 次）地分配过程，使得原来分配系数具有微小差 别的各组分， 产生了保留能力明显差异的效果， 进而各组分在色谱柱中的移动速 度就不同， 经过一定长度的色谱柱后， 彼此分离开来， 最后按顺序流出色谱柱而 进入信号检测器， 在记录仪上或色谱数据机上显示出各组分的色谱行为和谱峰数 值。测定各组分在色谱图上的保留时间 （或保留距离），可直接进行组分的定性； 测量各峰的峰面积，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法（即外标法）测 定相应组分的含量。 高效液相色谱仪是实现液相色谱分离分析过程的装置。 高效 液相色谱仪系统由储液器、 泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。 本实验采用十八烷基化学键合相作固定相，甲醇 / 水或乙醇 /水作流动相，采 用标准曲线法进行咖啡因的定量测定。 咖啡因为白色或带极微黄绿色、有丝光的针状结晶；无臭，味苦；为中枢兴 奋药。 三、实验仪器与试剂 液相色谱仪（岛津 2010），50uL 微量注射器， ODS C18 柱，重蒸水，色谱甲 醇，含咖啡因水样品。 四、实验步骤 1．实验条件 固定相：ODS C18柱； 流动相 ： 甲醇-水(60-40)；流速 1.0 ml/min ；检测波长： 254nm；柱温：室温 。 五、 咖啡因含量测定 （1）标准曲线的绘制 在 5 只 50ml 容量瓶中，分别加入一定量的 1000 mg/L 咖啡因标准溶液， 以重 蒸水定容至刻度线， 摇匀，得到 20mg/L 、40mg/L 、80mg/L 、160mg/L 和 320mg/L 标液浓度。 然后用微量注射器准确抽取 5.0 μL溶液，注射入进样口。注意不要将气泡 抽入针筒。在相同的色谱条件下，分别测定各标准溶液。根据标准溶液的浓度与 对应的峰面积 A 值，绘制 A — C 标准曲线。 表 咖啡因浓度与峰面积关系 浓度 mg/L 20mg/L 40mg/L 80mg/L 160mg/L 320mg/L 峰面积 （2）未知液的测定 将咖啡因待测液在同样条件下测定，根据测得的峰面积在标准曲线图上查出 其浓度。 【思考题】 1．试述高效液相色谱内标法定量的优点。 2 ．高效液相色谱法流动相选择依据是什么？