测量蛋白质含量地方法.pdfVIP

蛋白质含量测定 蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常 用的方法有凯氏定氮法 (Kjedahl ）、双缩脲法 (Biuret) 、紫外吸收法、考马斯亮蓝 法 (Bradford) 。其中 Bradford 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 10~20 倍 Biuret 法灵敏 100 倍以上。 凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的 蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。 1. 凯氏定氮法 1．1 原理 凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸 收和滴定 4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热 消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与 — 酸作用，变成硫酸铵。然后加碱蒸馏 放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白 质含量。 1．2 特点 凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮 最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。该凯氏定氮法 适用范围广泛，用于标准蛋白质的准确测定，干扰少，干扰是非蛋白氮（可用三氯 乙酸沉淀蛋白质而分离）测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量 大。费时太长，通常 8-10 个小时，灵敏度低，测定范围是 0.2-1.0mg 。 2. 双缩脲法 2 ．1 原理 双缩脲 (N}I3C0NHC0NH是两个分子脲经 180℃左右加热，放出 1个分子氨后得到 的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡 具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以 1个中间碳原子相连的肽键，这 类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白 质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。 2.2 特点 双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响 . 采用 0．5 g 样品， 40 mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色 的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，干 扰物质少，如硫酸铵， Tris 缓冲液，某些氨基酸。但灵敏度差，测定范围为 l ～2O mg蛋白质， 20-30min 。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用 于谷物蛋白质含量测定。 3. 紫外光吸收法 3．1 原理 蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白 质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在 280 nm处，其吸光度 ( 即光密度值 ) 与蛋白质含 量成正比。此外，蛋白质溶液在 238 nrll 的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定 波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的 测定。 3．2 特点 最常用的紫外吸收法是 280 nm的光吸收法，紫外吸收法简便、较灵敏、快 速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。较高灵敏，测定 范围是 50-100ug ，用于层析柱流出液的检测，时间较快， 5-10min 。缺点是，准确 度较差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪 氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸 关，等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再 进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相 同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。紫外吸收法测定时， 由 于蛋白质吸收高峰常因 pH的改变而有变化，因此要注意溶液的 pH值，测定样品时的 pH要与测定标准曲线的 pH相一致。 4. 考马斯亮蓝法