基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响及分子机制初探.pdf

重庆大学硕士学位论文 中文摘要 摘 要 癌症是严重危害人类生命的恶性疾病，每年导致的死亡人数仅次于心脑血管 疾病。肝癌恶性程度高，预后差，致死率高。在中国，肝癌的发病率和死亡率远远 高于世界平均水平。肝癌干细胞（Liver cancer stem cells ，LCSCs ）是肝癌细胞中数 量极少的一群细胞，具有自我更新能力和转移潜能，对药物和放射治疗不敏感，在 肝癌的转移和复发中起关键作用。研究表明，癌干细胞（Cancer stem cells ，CSCs ） 具有表型可塑性，即癌细胞可以在一定条件下转换为CSCs ，而CSCs 也可以分化 为癌细胞。这两者表型之间如何转换，在什么条件下相互转换？目前的研究仍存在 争议。 以往的研究表明力学因素能够影响干细胞的分化，例如不同的基质刚度能够 诱导间充质干细胞 （Mesenchymal stem cells ，MSCs ）分化为不同类型的细胞。由 于癌干细胞和正常干细胞具有类似性，研究者们也发现了力学因素能够诱导CSCs 分化为癌细胞或者诱导癌细胞向 CSCs 方向逆转化。例如流体剪切力可以诱导 LCSCs 分化为肝癌细胞，流体剪切力可以诱导肺癌细胞获得癌干细胞表型。这些 结果都表明力学因素能够引起癌细胞/CSCs 表型的变化。肝癌组织具有力学异质性， 即肝癌组织的基质刚度分布并不是均一性的。在一个肿瘤组织中，肿瘤组织边缘和 内部位置的基质刚度具有明显的差异，同时CSCs 在一个组织内部的分布也是不均 匀的。此外，肝纤维或肝硬化引起的肝基质刚度增加往往会引起肝脏组织癌变，肝 癌组织的刚度远远高于正常肝组织。两方面的原因都提示肝癌的发生发展与基质 刚度有直接联系。而在这其中基质刚度是否能够影响肝癌细胞的癌干细胞表型，目 前的研究报道仍很少。 整合素β1 （Integrin-β1 ）是一种跨膜蛋白，在以往的研究中被认为是一种力敏 感分子，能够调节细胞的迁移、增殖、粘附能力等。Integrin-β1 在近年来的研究中 被发现在癌症的发生发展中起到了重要的作用。同时也有部分文献显示Integrin-β1 能够调控癌细胞的癌干细胞表型。 基于此，本文考察了基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响，对其中的分子 机制进行了探索。主要的研究内容和结果如下： ① 不同刚度基质细胞培养模型的构建 本文采用聚丙稀酰胺 （Polyacrylamide ，PA ）水凝胶构建实验模型。通过调节 配方中丙烯酰胺（Acrylamide ）和双丙烯酰胺（Bis-acrylamide ，Bis ）的配比来构建 不同刚度的水凝胶。本文构建的聚丙烯酰胺水凝胶的刚度可控，能够模拟正常肝脏 （5.9 kPa ）或病变肝脏（24.8 kPa 、48.1 kPa ）的基质刚度。在刚度可控的同时为细 I 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 胞提供良好的生长界面。为研究肝脏病变力学机制提供了一个新的体外研究平台。 ② 基质刚度对肝癌细胞癌干细胞表型的影响 为探究基质刚度能否影响肝癌细胞癌干细胞表型，本文通过形态学、细胞骨架、 干细胞相关基因、肝癌干细胞表面标志分子、侧群细胞（Side population cells，SP ）、 细胞周期、成球能力、克隆形成能力、耐药性、裸鼠成瘤能力等多个方面来综合考 察癌干细胞表型是否发生变化。结果发现，5.9 kPa 的基质刚度能够使细胞铺展减 少、骨架聚合减少，增加细胞的癌干细胞相关基因Oct-4、Sox-2 、CXCR4 的表达和 肝癌干细胞表面标志分子CD133 和CD90 阳性细胞数量，聚集更多的SP 细胞。细 胞在 5.9 kPa 的基质上具有更缓慢的细胞周期、更强的成球能力和克隆形成能力。 5.9 kPa 的基质刚度能够使细胞在药物索拉菲尼和5-氟尿嘧啶的处理下保持较强的 克隆形成能力。最后研究从动物模型上证明了在5.9 kPa 基质刚度上培养的肝癌细 胞具有更强的致瘤能力。实验结果表明，较软的（5.9 kPa ）基质刚度能够诱导肝癌 细胞MHCC97H 的癌干细胞表型的增加。 ③ 基质刚度