莱氏野村菌Nr01-ym Nrlac1基因的克隆与功能研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 作为一种昆虫病原真菌，莱氏野村菌在田间自然条件下，可以侵染斜纹夜蛾 等多种夜蛾科害虫，并具有大多数生防真菌所具有的环境友好无污染、循环侵染 及不易让宿主产生耐药性等诸多优点。因此，具有制成生防农药来代替化学农药 应用于害虫防治的价值。目前真菌类生防制剂的有效性成分一般为分生孢子。然 而，莱氏野村菌作为生防类真菌，产孢周期较长，同时对于产孢条件如光照、温 度、湿度等都较为严苛。因而，对于莱氏野村菌产孢特性和抗逆机制进行研究是 十分必要的。 本研究前期获得了一株 T-DNA 插入导致的分生孢子颜色突变菌株 （Nr01-ym ）。野生型莱氏野村菌分生孢子颜色为深绿色，而Nr01-ym 分生孢子变 为了黄色。为了找到被破坏基因，将突变株进行全基因组测序，分析数据后发现 T-DNA 插入位点为漆酶基因Nrlac1 的上游启动子区域。为了进一步验证全基因组 测序的结果，构建Nrlac1 敲除及回复菌株，并对Nrlac1 基因功能进行了进一步探 究。获得了如下结果： ① Nrlac1 基因敲除和回复菌株的获得 根据莱氏野村菌全基因组序列获得lac1 基因上下游各2000bp 左右的序列，并 按照本实验室载体骨架选择合适的酶切位点构建Nrlac1 敲除和回复载体。将含构 建成功的敲除和回复质粒的农杆菌分别与野生型和缺失突变体芽生孢子进行共培 养，筛选得到突变菌株△Nrlac1 以及回复菌株CP 。并进行Southern 验证。 ②△Nrlac1 菌株基础表型 在 SMAY 基础培养基上，△Nrlac1 菌株的分生孢子为黄色，孢子堆积紧凑， 粘附性强。而野生型菌株的分生孢子为绿色，孢子堆蓬松、易飞散。孢子堆积紧 凑，粘附性强等特点导致了莱氏野村菌突变株孢子随风扩散的能力下降，影响了 孢子在野外田间进行循环侵染的能力。 ③突变菌株应对紫外和湿热胁迫的能力下降 Nrlac1 基因缺失后，在相同时间相同强度的紫外照射和湿热胁迫处理后发现， 与野生型相比，△Nrlac1 分生孢子萌发速率显著降低。且同样紫外条件处理后突变 菌株的紫外修复相关基因表达量相较野生型也存在显著降低。该结果显示莱氏野 村菌分生孢子绿色色素有利于孢子抵抗极端环境变化，从而提供生存优势。 ④Nrlac1 基因缺失对色素沉积的影响 提取分生孢子黑色素后定量分析显示WT 黑色素含量远高于△Nrlac1 ，这证明 黑色素是莱氏野村菌孢子色素的重要组成成分，同时Nrlac1 基因参与了莱氏野村 I 重庆大学硕士学位论文 菌分生孢子色素或黑色素的合成。提取WT 和△Nrlac1 微菌核的色素后发现，两菌 株的微菌核色素无显著差异，这表明莱氏野村菌分生孢子绿色色素与微菌核色素 可能是两个相对独立的合成通路。 ⑤Nrlac1 基因缺失对毒力的影响 选取健康状态良好的斜纹夜蛾三龄幼虫为试验材料，通过体表点滴和体内注 射两种方式来测定Nrlac1 基因缺失后的致病力变化。结果显示点滴处理的情况下 突变体半致死时间较野生型菌株延迟1d 左右，而注射处理无显著差异。表明Nrlac 1 基因的缺失小幅度降低了突变菌株侵染力。 关键词:莱氏野村菌；Nrlac1 ；孢子色素；黑色素；毒力 II 英文摘要 Abstract As an entomopathogenic fungus, Nomuraea rileyi can naturally infect a variety of noctuidae pests such as Spodoptera litura. Compared with chemical insecticides, biopesticides are eco-friendly, free of contamination, circularl