不同基底硬度下干细胞及肝星状细胞收缩力与相关蛋白活性研究.pdfVIP

中文摘要 摘 要 为探索细胞因基底硬度不同而产生的力学信号与由细胞因子和蛋白激酶活性 作用所产生的化学信号交互关系，阐明细胞收缩力在其中可能扮演的角色，探寻 干细胞治疗肝纤维化过程中，力学信号与其他信号分子间的相互作用及其机制， 本实验研究结合文献报道在体外构建近似于正常肝组织，肝纤维化初期肝组织及 肝硬化阶段肝组织硬度的聚丙烯酰胺水凝胶（polyacrylamide gel, PA ）细胞培养系 统。观察不同硬度基底上骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs ）和肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs ）在其上的生长情况并检测细 胞增殖活力，运用免疫荧光染色技术考察基底硬度对细胞骨架及FAs 装配的影响， 利用牵引力显微镜技术表征不同硬度基底上不同细胞的收缩力大小，及 TGF-β1， sFRP-1 细胞因子对收缩力的影响，进而通过细胞磷酸化组学研究探索基底硬度对 细胞相关信号通路的影响。 细胞在不同硬度基底上均表现出良好的生长状态，免疫荧光染色结果显示， 基底硬度显著影响细胞骨架及FAs 装配，高硬度基底促进骨架成熟装配及FAs 形 成。牵引力测量结果显示，平均基底微元应力模量 （mean modulus of substrate elements stress, MSES ）、弹性基底吸收的弹性应变能、细胞预应力三个指标随基底 硬度增加其总体趋势均为增加，基底硬度对细胞的影响具有一致性。细胞通过调 整骨架及 FAs 装配调节收缩力大小，以此感知基底硬度的力学信号，进而调整细 胞形态及功能。 在HSCs 组，sFRP-1 在三个硬度上对MSES 没有显著性影响，对弹性应变能 及细胞预应力的影响则不具有一致性，在3.4 kPa 降低，8.8 kPa 增加，表明在HSCs 细胞中Wnt 信号通路参与细胞收缩力的调节，其过程与基底硬度的影响之间存在 反馈。TGF-β1 在三个硬度上则始终促进MSES 值，弹性应变能及细胞预应力增加， 表明TGF-β1 可促进细胞收缩力的产生。在MSCs 组，sFRP-1 在8.8 kPa 使三个力 学指标显著降低，在3.4 kPa 降低MSES 但其他两个指标无显著性差异，17.6 kPa 上三个力学指标则均无显著性差异，该结果提示我们在8.8 kPa MSCs 细胞Wnt 信 号通路激活更为明显。TGF-β1 在三个硬度上对MSES 的影响不具有一致性，在3.4 kPa ，8.8 kPa 上降低，17.6 kPa 上显著升高。弹性应变能及细胞预应力则除8.8 kPa 外均显著提高，提示TGF-β1 在软和硬基底上可引起细胞不同的响应，但其整体上 提高了干细胞对基底的能量输出能力及自身收缩能力。在3.4 kPa 上或由于基底不 能提供足够的对抗力，因此MSES 反而下降，同时8.8 kPa 的响应存在一定的矛盾 之处。结合sFRP-1 的结果，可认为此硬度对干细胞有较为特别的意义，或与Wnt I 重庆大学硕士学位论文 信号通路有关。 磷酸化定量蛋白质组检测显示，在 MSCs 组，随硬度增加，可通过黏着斑信 号通路、微丝骨架调节通路、平滑肌细胞收缩通路等相关信号通路调节细胞收缩 力，并解除干细胞G1 期滞留促进增殖。HIF-1 信号通路随硬度增加而上调，提示 有可能通过促进TIMP-1 等在内的相关因子促进肝纤维化。在HSCs 组，TGF-β 信 号通路、细胞周期通路、NF-kappa B 信号通路、Wnt 信号通路等相关信号通路， 随硬度增加而激活，其整体调节结果为起始细胞周期运行，降低细胞凋亡促进 HSCs 细胞存活与增殖。由于我们所用的HSCs 为激活后的星状细胞，硬度增加促 进其增殖与存活。因此，我们可以认为硬度增加促进肝纤维化进程并且该进程与 上述通路相关。 关键词：肝纤维化；骨髓间充质干细胞；肝星状细胞；细胞力学生物学；基底硬度 II 英文摘要