细胞的冻存与复苏培训讲学.docVIP

细胞的冻存与复苏 为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度为－196℃，将细胞收集至冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冷冻后，最终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。 复苏一般采用快速融化方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解，然后将细胞转入培养器皿中进行培养。 一、细胞的冻存 （一）仪器、用品与试剂 细胞培养箱、液氮罐、普通冰箱、－80℃超低温冰箱、离心机、冻存管、离心管、冻存盒、倒置显微镜、吸管、废液缸、添加有0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化液、细胞冻存液（10ml体系：含7ml培养基、2ml FBS、1ml 甘油或DMSO）、细胞培养基（如添加有10％FBS的RPMI1640）等。 （二）方法 1、取旺盛生长的、已基本上快要长满细胞的培养瓶，小心吸干瓶内培养液。给每个培养瓶中加入1-2ml胰蛋白酶消化液，37℃消化细胞。 2、待大部分细胞从瓶壁脱落下来后，加入3-5ml细胞培养基终止消化。 3、1000rpm 离心5分钟，收集细胞沉淀。 4、加入适量细胞冻存液，调整细胞密度在1-10×106个/ml。 5、将上述细胞悬液小心分装入冻存管中，拧紧冻存管盖子，标注清楚细胞名称、冻存日期等内容。 6、置4℃普通冰箱中预冷30min或者1h。 7、将冻存管放入冻存盒中，立即转移入－80℃超低温冰箱过夜。 8、将冻存管转移入液氮罐中，在记录本上记录清楚细胞冻存管的位置、名称等信息。 （三）注意事项 1、冻存细胞的生长状态要好，建议在冻存前24小时内对培养基进行换液，冻存前培养瓶中细胞的密度不宜过高。 2、冻存液的配方可根据细胞种类之不同进行适当调整，血清的浓度可以更高一些，甘油和DMSO的浓度也可在5-20%之间调整。 3、最好在冻存后的数天里任意选取一支所冻存的细胞进行复苏，用以鉴定冻存效果。 4、DMSO有毒，应戴手套操作；将冻存管放入液氮罐中时，应防止被溅出的液氮冻伤。 二、细胞的复苏? （一） \t /experiment/_blank 仪器、用品与 \t /experiment/_blank 试剂 37℃水浴锅、离心机、 \t /experiment/_blank 离心管、培养瓶、细胞培养箱、倒置显微镜、吸管、废液缸、细胞培养基、70％酒精浸过的棉球等。 （二）方法 1、准备工作：开启恒温水浴锅，将温度调节在37℃，取一 \t /experiment/_blank 离心管，加入10ml \t /experiment/_blank 细胞培养基。 2、从液氮罐中小心取出冻存管，立即放入 \t /experiment/_blank 水浴锅中快速摇晃让冻存液融化。 3、用酒精棉球擦洗冻存管外部以降低污染机会。 4、打开冻存管，将冻存液小心转移到预先加入有培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟。 5、小心弃掉上清，加入5ml左右培养基重悬细胞。 6、将所得细胞悬液转移入培养瓶中，盖上瓶塞，置培养箱培养。 （三）注意事项 1、冻存液融化要迅速，但不宜完全融化后再洗涤，应在 \t /experiment/_blank 水浴时保留一小块冰块。 2、洗涤的次数可适当增加，以尽可能除去冻存液成分的残留。 3、若是复苏冻存在安瓶中的细胞，应格外小心，防止玻璃瓶爆炸伤害机体。 4、离心速度不宜太高，避免对细胞的损伤。 中学语文教育界一颗耀眼的星星 ——记北京中学语文特级教师姚家祥校友 “我今天所取得的知识、能力，都是母校给我的。我就算忘记了我自己，也不能忘记我的母校。” ——姚家祥 “1938年12月22号，在江苏省镇江市，一条普普通通的巷子，一个普普通通的人家，又增添了一颗幼小的心脏，并强有力地跳动着。”这是1957年，姚家祥高考作文的开头。那一年，全国招收近十万名大学生，他就是其中的一员——一位从历史悠久的江苏镇江北固山来到华东师大中文系的年轻学子。 从北固山到丽娃河 谈起20世纪50年代的师大，姚家祥无限怀念地说：“那会儿师大真是美极了！校园北部也是小桥流水，那个河面上可以划船，可美啦！”话语中充满了幸福感。当时华师大在上海另有一个别称，叫做“师大公园”。如今砖砌的围墙，那时都是竹子做的篱笆。丽娃河也比现在长一些，学生们泛一叶扁舟，在河中徜徉，真是赏心乐事。矛盾曾在小说《子夜》中描述它“绿荫如幔，芳草如茵”，情景之美令诗意的青年联想起塞纳河畔的旖旎风光。 1957年至1961年，是多事之秋。当年的中文系虽然年轻，却有着施蛰存、程俊英、许杰、钱谷融