DB37T 4101-2020苹果轮纹病菌快速检测方法.pdf

ICS 65.020.20 B 16 DB37 山 东 省 地 方 标 准 DB37/T 4101—2020 苹果轮纹病菌快速检测方法 Rapid detection of botryosphaeria dothidea 2020 - 08 - 31 发布 2020 - 10 - 01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 4101—2020 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为GB/T 6682中规定的一级水。 1) 5.1 等温扩增PCR 混合液（2×Lamp PCR Master Mix ）：包含40 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L (NH ) SO 、 4 2 4 20 mmol/L KC1 （pH 值为8.8）、16mmol/L MgSO 、2.0 mmol/L dNTPs、0.2 % Trion X-100。 4 5.2 Bst DNA 聚合酶：酶浓度8 U/ μL。 5.3 显色液：SYBR Green I 荧光染料，1 000×。 5.4 引物：根据苹果轮纹病菌ITS 基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1 （F3），外引物2 （B3）， 内引物1 （FIP），内引物2 （BIP），环引物1 （LF）和环引物2 （LB）。外引物扩增片段长度：189bp， 引物序列见附录A。 2) 5.5 DNA 快速提取液：DNA-EZ Reagents All-DNA-Fast-Out 。 5.6 甜菜碱：5 mol/L。 5.7 离心管：0.1 mL、1.5mL。 5.8 塑料研磨棒：长度70 mm，研磨头外径6.2 mm，研磨头长度9.5 mm。 6 仪器设备 6.1 恒温箱：满足65 ℃±3 ℃、80 ℃±1 ℃要求。 6.2 移液器：量程0.5 μL～10 μL，量程10 μL～100 μL，量程100 μL～1 000 μL。 7 测定步骤 7.1 试验设置 7.1.1 阴性对照：采用不含有目标基因序列的苹果腐烂病菌（Valsa mali）基因组DNA 为模板。 7.1.2 阳性对照：采用含有目标基因序列的苹果轮纹病菌（Botryosphaeria dothidea ）基因组DNA 为模板，浓度应略高于方法检出限。 7.1.3 空白对照：以水代替DNA 模板。 7.2 试样采集 进行田间轮纹病菌快速检测时，切取约0.5 cm×0.5 cm待检测的苹果组织（果实、叶片、枝条）， 放置于1.5 mL离心管中保存并标记。 7.3 试样DNA 提取 7.3.1 将100 μL DNA 快速提取液加入到盛有试样的1.5mL 离心管中，用研磨棒研磨5 min。 7.3.2 80 ℃±1 ℃加热5 min，如果是难以破裂的细胞和材料，则保温时间可以延长到10min～30 min。 7.3.3 用手振荡混匀后取裂解物直接进行LAMP 反应。 7.4 LAMP 反应步骤 7.4.1 反应体系 1) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的 认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2) 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并