课题3 血红蛋白的提取和分离 2.ppt

课题 3 血红蛋白的提取和分离 主要内容： 一、基础知识 二、实验操作 一、基础知识 --- 蛋白质分离和提取的原理 ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法） 1 、凝胶： 一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通 道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖） 2 、概念： 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的 有效方法 3 、原理： 分子量 大 小 直径大小 大于凝胶颗粒空 隙直径，被阻挡 在颗粒的外面 小于凝胶颗粒空 隙直径，可以进 入颗粒内部 运动方式 垂直向下移动 垂直向下移动， 无规则扩散进入 颗粒内部 运动速度 较快 较慢 运动路径 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱洗脱 出来 后从凝胶柱洗脱 出来 一、基础知识 --- 蛋白质分离和提取的原理 4 、具体过程 一、基础知识 --- 蛋白质分离和提取的原理 1 、概念： 在一定的范围内，能对抗外来少 量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液 PH 发 生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓 冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 ㈡ 缓冲溶液： 2 、作用： 能够抵制（ ）对溶液 （ ）的影响，维持 PH 基本不变 。 外界的酸或碱 pH 值 3 、缓冲溶液的配制 通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中 配制而成。调节缓冲剂的（ ） 就可以制得（ ）使用的缓冲液。 1 － 2 使用比例 在不同 PH 范围内 思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 H 2 CO 3 / NaHCO 3 磷酸缓冲液， 保证血红蛋白的正常结构和 功能，便于观察 ( 红色 ) 和科学研究其 ( 活性 ) 4 、在本课题中使用的缓冲液？ （三） 电泳： 1. 概念： 带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 2. 原理： ①许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的 PH 下， 这些基团会带上正电或负电。 ②在电场的作用 下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的 电极移动。 ③电泳利用了待分离样品中各种分 子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状 的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从 而实现样品中各种分子的分离。 3. 类型 : 琼脂糖 凝胶电泳、 聚丙稀酰胺 凝胶电泳 在电场的作用下，这些带电分子会向着与 其所带电荷相反的电极移动 琼脂糖凝胶电泳示意图 4 、 聚丙稀酰胺凝胶电泳 （ 1 ）聚丙稀酰胺凝胶： 是由单体丙烯酰 胺和交联剂 N,N ， 亚甲基双丙烯酰胺在引发剂 和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网 状结构的凝胶。 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的 迁移率 取 决于它所带 净电荷 的多少以及 分子的大 小 等因素。 为了消除 净电荷对迁移率的影响， 可以 在凝胶中加入 SDS 。 （ 2 ）原理： SDS 能使蛋白质发生完全变性。 由几条肽 链组成的 蛋白质复合体 在 SDS 的作用下会 解聚成单条肽链 ，因此测定的结果只是 单条肽链的分子量 。 SDS 能与各种蛋白质 形成 蛋白质— SDS 复合物， SDS 所带负电 荷的量大大超过了蛋白质分子 原有电荷 量。 因而掩盖了 不同种蛋白质间的电荷 差别 ，使电泳迁移率完全取决于分子的 大小。 （ 3 ） SDS- 聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理 : 4 、 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质的提取和分离一般分为四步： （ 1 ）样品处理：包括洗涤红细胞；血 红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红 蛋白溶液。 （ 2 ）粗分离：透析除去分子较小的杂 质。 （ 3 ）纯化：通过凝胶色谱法将分子量 较大的杂质蛋白质除去。 （ 4 ）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定。 二、实验操作： 样品处理 → 粗分离 → 纯化 → 纯度鉴定 血 液 血浆 水 分 其他物质： 血 浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ 90 ％） 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁红素基团 1. 血液有哪些成分？ 2. 你认为鸟类血液和哺乳动物血液中，最好 哪种血液来提取血红蛋白？为什么？ 二、实验操作： 样品处理 → 粗分离 → 纯化 → 纯度鉴定 知