SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)实验原理和操作步骤.docVIP

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)实验原理和操作步骤 实验原理： SDS是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法是依据混合蛋白的分子量不同来进行分离的。 SDS是一种去垢剂，可与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其广泛存在于一个广泛均一的溶液中。SDS蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。在样品介质和凝胶中加入强还原剂和去污剂后，电荷因素可被忽略。蛋白亚基的迁移率取决于亚基分子量。 试剂和器材： 试剂：1. 5x样品缓冲液（10ml）:0.6ml 1mol/L的Tris-HCl(pH6.8),5ml 50%甘油，2ml 10%的SDS，0.5ml巯基乙醇打开二硫键的作用，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml蒸馏水。可在4℃ 打开二硫键的作用 2. 凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺30g，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加重蒸水溶解后，定容到100ml。过滤后置棕色瓶中，4℃保存，一般可放置1个月。 3. pH8.9分离胶缓冲液： Tris 36.3g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9，定容至100ml， 4℃保存。 4. pH6.7浓缩胶缓冲液： Tris 5.98g ，加1mol/L HCl 48ml，加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7，定容至100ml， 4℃保存。 5. TEMED（四乙基乙二胺）原液 6.10%过硫酸铵（用重蒸水新鲜配制） 7. pH8.3 Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水约900ml，调pH8.3后，用蒸馏水定容至1000ml。置4℃保存，临用前稀释10倍。 8. 考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250，溶于200ml蒸馏水中，慢慢加入7.5ml 70%的过氯酸，最后补足水到250ml，搅拌1小时，小孔滤纸过滤。 器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。 实验操作 （一）样品制备 将蛋白质样品与5X样品缓冲液（20ul＋5ul）在一个Eppendorf管中混合。放入100℃加热 5－10min，取上清点样。 （二）分离胶及浓缩胶的制备1 将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O 冲洗数次，再用乙醇擦拭，晾干； 2 将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer，按照Bio-Rad Mini Ⅱ/Ⅲ说明书提示装好玻璃板； 3 按如下体积配制10％分离胶8.0 ml，混匀； ddH2O 3.0 ml 1.0 mol/LTris-HCl缓冲溶液，三羟甲基氨基甲烷 pH=8.8 2.1 ml 缓冲溶液，三羟甲基氨基甲烷 30% Acr-Bis甲叉双丙烯酰胺 2.8 ml 甲叉双丙烯酰胺 10% SDS 十二烷 十二烷基磺酸钠，使蛋白质变性 10%AP过硫酸铵，助氧化剂，加速胶的凝固 56 ul 过硫酸铵，助氧化剂，加速胶的凝固 TEMED催化过硫酸钠产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 催化过硫酸钠产生自由基，从而加速丙烯酰胺凝胶的聚合 4 向玻璃板间灌制分离胶，立即覆一层重蒸水，大约20 min后胶即可聚合； 5 按如下体积配制6％浓缩胶3.0 ml，混匀；ddH2O重蒸水 1.0 mol/LTris-HCl pH=6.8 30% Acr-Bis 重蒸水 2.0 ml 400 ul 600 ul 10% SDS 10% AP TEMED 36ul 24ul 4ul 6 将上层重蒸水倾去，滤纸吸干，灌制浓缩胶，插入样品梳； 7 装好电泳系统，加入电极缓冲液，上样20 μl; 8 稳压200V，溴酚蓝刚跑出分离胶时，停止电泳，约需45 min～1hr. 9 卸下胶板，剥离胶放入染色液中，室温染色1～2 hr；加入脱色液，置于80 rpm脱色摇床上,每20 min更换一次脱色液（10 ml 冰乙酸；45 ml乙醇；45 ml蒸馏水）至完全脱净。