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几种常见的抗体标记方法 -酶标记、荧光素标记、同位素标记、 生物素标记 抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。 一、酶标记 1、辣根过氧化物酶 (HRP) 标记 辣根过氧化物酶 (HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。其 原理是 HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体 IgG 后该醛基与 IgG 氨基结合， 形成 Schiff 氏碱。为了防止 HRP 中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化 前先用二硝基氟苯阻断氨基。氧化反应末了，用硼氢化钠稳定 Schiff 氏碱。这里介绍两种程序。 程序一： (1) 将 5mg HRP 溶于 0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中 ; 加  0.5ml 10mmol/L NaIO4  溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用  2 小时。 (2) 加  0.75ml 0.1mol/L Na2CO3  混匀。 加入 0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等 (15mg/ml) ，混匀。 (4) 称取 Sephadex G25 干粉 0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的 5ml 注射器外筒内 ; 随后将上述交联物移入注射器外套 ;盖紧，室温作用 (避光 )3 小时或 4℃过夜。 用少许 PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加 1/20V 体积新鲜配制的 5mg/ml NaBH4 溶液，混匀，室温作用 30 分钟 ;再加入 3/20V NaBH4 溶液，混匀，室温作用 1 小时 (或 4℃过夜 )。 将交联物过 Sephadex g200 或 Sepharose 6B(2.6 × 50cm) 层析纯化，分管收集第一峰。 酶结合物质量鉴定： 克分子比值测定 酶量 (mg/ml)=OD403 × 0.4 IgG 量 (mg/ml)=(OD280- OD403× 0.3) × 0.62 克分子比值 (E/P)= 酶量× 4/IgG量，一般在 1-2 之间。酶 结合率 = 酶量×体积 /抗体，标记率一般为 0.3-0.6 ，即 1-2 个 HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于 0.6 ，0.8 ， 0.9;OD403/OD280 等于 0.4 时， E/P 约为 1。 标记率 =OD403/OD280 酶活性和抗体活性的测定可应用 ELISA 法、免疫扩散、 DAB-H2O2 显色反应测定酶结合物的酶活性， 抗体活性及效 价、特异性。 (8)HRP 抗体结合物的保存：加入等量甘油后，小量分 装-20℃存放， 防止反复冻融 ;或加入等量 60% 甘油 4℃保存 ; 不宜加 NaN3 或酚防腐，否则会影响酶活性。必要时冻干保 存，以 BSA 或脱脂牛奶作保护剂。 程序二： (1) 将 5mg HRP 溶于 0.3mol/L PH8.1 NaHCO3 溶液中，加入 1% 二硝基氟苯无水乙醇溶液 0.1ml ， 室温搅拌作用 1 小时，以封闭 HRP 分子上的 α和 ε氨基。 再加 1ml 0.06mol/L 过碘酸钠溶液， 在室温中避光轻 30 分钟，溶液呈黄绿色 ;随后加 1ml 0.06mol/L 乙二醇，轻搅 1 小时，中止氧化反应。 (3) 移入透析袋中，在 1000ml 0.01mol/L PH9.5 碳酸盐缓冲液中， 4℃透析过夜，更换三次缓冲液， 注意避光。 吸取上述醛化好的 HRP 溶液 3ml ，加入 5mg IgG 的碳酸盐缓冲液 1ml ，室温轻搅 2-3 小时，避光 ;加入 5mg NaBH4 ， 4℃放置 3 小时或过夜，或换用乙醇胺 (2mol/L PH9.5)0.2ml ，作用 7 小时。 (5) 再移入透析袋中，在 0.02mol/L PH7.4 PBS 中透析 小时，更换三次缓冲液。 用 3000r/min 离心 30 分钟，除去沉淀物。上清液再 用半饱和硫酸铵盐析三次，沉淀用少许 PBS 溶解，透析或 层析除盐，必要时进一步层析纯化。 (7) 、 (8) 步骤同程序一。 2、碱性磷酸酶 (AP) 标记 碱性磷酸酶 (AP) 用于标记抗体，常用戊二醛一步法，将 酶和单抗混合， 再加入适量戊二醛， 使酶和抗体蛋白的 NH2 分别与两个醛基结合，制备成结合物。该法简便，但所得产 物不均一，抗体活性损失大，酶标记率低。其程序如下： 将 5mg AP 加入 1ml 抗体溶液 (2mg/ml) 中溶解，装入透析袋，于 4℃对 0.01mol/L PH7.2 PBS 透析 18 小时，换液三次。 加入 2.5% 戊二醛 20ul ，室温作用 1-2 小时， 4℃对 PBS