免疫电泳技术.docx

免疫电泳技术 一、  概念 免疫电泳技术是将凝胶内的沉淀反应与蛋白质电泳相结合的一项免疫检测技术， 其实质是在直流电场中让抗原与抗体在凝胶中快速定向扩散，根据沉淀线 （环） 的有无，判断样品 中有无与诊断抗体（或抗原）对应的抗原（或抗体） 。免疫电泳技术具有灵敏度高、分辨力强、反应快速和操作简便等特点。 二、 基本原理 将抗原抗体凝胶扩散系统置于直流电场中， 在电流作用下， 抗原及抗体向异相电荷的电极快速泳动，缩短了两者结合时间，加快了沉淀现象的产生。 免疫电泳的主要影响因素如下。 1、 抗原与抗体特性： 抗原或抗体的泳动速度与其所带静电荷量、分子量几物理形状等有关，静电荷量越多、颗粒越小，电泳速度越快，反之越慢。在同一电场中，单位时间内个种带电粒子的移动距离称电泳迁移率。当有多种带电荷的蛋白电泳时，由于静电荷量不同而区分成不同区带，得以区分不同的抗原抗体复合物。 2、 电场因素： 电场强度、溶液 PH、离子强度、电渗现象（是指在电场中水对固相介质的相对移动，不影响蛋白质的分离，但影响其原点位置）等。 三、  免疫电泳技术（双向） 1、对流免疫电泳 是将双向琼脂扩散试验与电泳相结合的定向免疫扩散技术。 在琼脂板上打两排孔，在负电极侧的各孔内加入待检抗原溶液，在正电极侧的各孔内 加入诊断抗体溶液。 在电场中，在缓冲液为中，蛋白质抗原与抗体 IgG 均带负电荷，应都向正极泳动，与 受电渗作用影响的水流方向（向负极流动）相反。但由于抗原等电点较低（ pI4~5 ），在电场 中带净负电荷数量较多且分子量相对较小，能克服逆向水流作用保持向正极泳动；而 IgG 由于等电点较高 （ pI 位 6~7）带净负电荷较少且分子量大， 不能克服逆向水流作用， 因而顺 水流方向朝负极泳动， 致使抗原和抗体在电场中相向泳动。 如果抗原与 IgG 对应，可在相遇 的最适比例处形成沉淀线。 对流免疫电泳敏感度比双向扩散试验高 8~16 倍，可测出 ug/L 量的蛋白质。 2、火箭免疫电泳 火箭免疫电泳原理是将单向扩散试验与电泳相结合的免疫扩散技术。 试验时，将抗体混合语琼脂中，样品孔中的抗原置于负极断，电泳时抗体不移动，抗 原向正极泳动， 随着抗原量的逐渐减少， 抗原泳动的基底区越来越窄， 抗原抗体分子复合物 形成的沉淀线逐渐变窄，形成个形状如火箭的不溶性复合物沉淀峰。 当琼脂中抗原浓度固定时，峰的高度与抗原呈正相关，因此用已知标准抗原作对照， 抗原浓度为横坐标， 峰的高度为纵坐标， 绘制标准曲线， 待测样品浓度就可根据沉淀峰的高 度在标准曲线中计算获得。 3、免疫电泳 是区带电泳和双向琼脂扩散相结合的一种免疫化学技术。 在普通琼脂板中央纵向挖一条宽的小槽，两侧各打一孔，将待测抗体与标准抗原分别 加入两侧孔内， 置于电场中进行电泳， 各抗原成分因电泳迁移率不同而分离成肉眼不可见的 若干区带， 取出去琼脂板，在中央槽内加入多克隆抗体， 当抗体自由扩散至槽外时，可与琼 脂板中相应抗原特异结合， 在抗原区带与槽之间相应位置形成不同形状和不同大小的沉淀弧 线。将待测样品与标准抗原相比较， 可分析检测样品中的抗原性质及成分。 此技术，目前主 要用于纯化抗原和抗体成分分析及正常和异常 Ig 的识别与鉴定，为定性试验，例如多发性 骨髓瘤患者血清在免疫电泳后，可观察到异常的 M蛋白沉淀弧。 4、免疫固定电泳 是区带电泳与免疫沉淀反应相结合的技术。 将样品蛋白加在琼脂凝胶板上区带电泳后，再将抗血清（滤纸条）直接加（贴）在凝胶 表面。 孵育后， 抗原与对应抗体特异结合形成沉淀带， 经固定后将电泳凝胶放在洗脱液中漂 洗，洗去游离的抗原或抗体，氨基黑染色后，将样品沉淀与标准抗原沉淀沉淀带比较观察。 可用于鉴定迁移率近似的蛋白和 M蛋白，免疫球蛋白轻链，尿液本周蛋白的检测及κ、 λ分型，脑脊液等的微量蛋白，游离轻链，补体裂解产物等 最大优势是分辨率强，敏感度高，操作周期短，仅需数小时，结果易于分析。 5、交叉免疫电泳 是将区带电泳和火箭免疫电泳相结合的免疫电泳分析技术。 交叉免疫电泳是一种有效的抗原蛋白定量技术， 可一次同时对多种抗原定量。 分辨率 较高， 有利于各种蛋白组分的比较， 对于蛋白质遗传多态性、 微小异质性、 蛋白质裂解产物 和不正常片段等进行定性分析。