武汉大学医学部 膜片钳安装培训 V.ppt

电压钳 (Voltage Clamp) 当细胞膜上的离子通道开放，产生跨膜电流；但是跨膜电流会引起膜电 位的改变。膜电位的改变一方面会影响离子通道的开放数量；同时也会影响 离子流过通道的驱动力。这两个因素反过来又对跨膜电流产生影响。此时记 录到的电流受多方面因素的影响，很难进行分析。 电压钳 是保持细胞膜电位不变，同时记录离子跨膜电流的一种方法。跨 膜电流是由 Na + , K + , Ca 2+ , Cl - 离子通过细胞膜上的离子通道所产生的。 Im Vm Vc ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － － － － － － － － Na ＋ Na ＋ 双电极电压钳原理图 e Cl － Ag/AgCl Vm ＝ Vc e Vm ＝ Vc 脑片膜片钳技术 1 ．脑片撕裂法（ Slice rending method ） （引自： Stuart et al ., 1993 ） （引自： Ascher P, 1989 ） 10 μM 10 μM a b （引自： The Axon Guide 》， 1993 。 有改动） 2 ．表面清洁法 （ Surface cleaning 法） 3. 红外微分干涉相差显 微镜法（ IR-DIC 法 ） 4. 盲法 （ Blind 法） 海马脑片 CA1 区锥体神经元的 IR-DIC 影象 海马脑片 CA1 区中间神经元的 IR-DIC 影象 微电极 神经元 举例一 离子通道研究 --------- Voltage-depended Ca2+ ion channel -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10 c h a n n e l c u r r e n t ( p A ) -60 -40 -20 0 20 40 60 depolarization potenial (mV) I/V curve 三、常见离子通道电流的记录： 1. Na + 通道电流：全细胞记录 离子通道动力学性质的研究 （以海马脑片全细胞记录模式为例） I A currents 2nA 20ms Na + currents I K currents Vh=- 80mV 40mV - 60mV 电 压 门 控 性 全 细 胞 电 流 2nA 10ms -50mV Conditioning pulses Testing pulses Vh =-90mV 钠 通 道 的 失 活 2nA 20ms -50mV Vh= -90mV 钠 通 道 失 活 后 的 恢 复 电 压 门 控 性 I K 电 流 5ms 2nA 50ms 1nA Vh= -70mV 70mV -50mV 70mV 60mV 50mV 电 压 门 控 性 钙 电 流 细胞的胞吐与胞吞功能测定 通过膜电容测定法可观测细胞内分泌颗粒 膜与胞质膜融合过程。膜电容在细胞膜不发生 折叠时，与细胞膜表面积成正比，因而可通过 膜电容的变化反映胞吐与胞吞过程及其机制。 另外，膜融合产生的一过性电流也可记录到。 几 乎 所 有 细 胞 的 脂 质 双 层 膜 其 电 容 均 为 1 μF/cm 2 与 Ca 2+ 通道邻近的递 质囊泡可被单一动作电 位激活而释放递质； 而远隔部位的囊泡则 需要一串动作电位的发 放。说明若要大量的递 质释放必须有大量的 Ca 2+ 进入。 Ca 2+ 通道 递质囊泡 光解释放技术 膜电容测量和微碳纤电化学测量 膜电容测量法和微碳纤电化学测量：时间分辨率高 （ ms 级）。 细胞分泌研究 ---- 电位依赖性分泌 7.96 7.92 7.88 7.84 7.80 p F 3 2 1 s -100 -50 0 50 p A 10uM forskolin control 细胞分泌 ---- 离子依赖性研究 --------with FLASH technology 100fF 500ms flash R=56.2/s Amp=33 fF R=0.505/s Amp=301.3 fF [Ca 2+ ] i =8.2μM 100fF 500ms flash R=44.8/s Amp=84.04fF R=4.3/s Amp=119.9fF [Ca 2+ ] i =4.72μM 500ms flash 100fF R=49.3/s Amp=42fF R=2.05/s Amp=316.8fF [Ca 2+ ] i =5.6μM 细胞内钙测定与膜片钳的结合 细胞内钙测定与膜片钳的结合 采用钙荧光测定技术和膜片钳技术同 时进行的手段，可实时地监测单一细胞内 游离钙浓度的变化与通道电现象变化的对 应关系。 荧光测钙技术 -PhotoMetry 系统 荧光测钙技术 -PhotoImage 系统 今天的膜片钳电生理学