抗坏血酸含量测定.docVIP

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2020-09-27 发布于浙江
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抗坏血酸含量测定.doc

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抗坏血酸含量测定试剂配制： 6%和10% (wt/vol) TCA（三氯乙酸），室温放置（~20℃） 43% (vol/vol) H3PO4 (1:1稀释 85% H3PO4)，室温放置 3% (wt/vol) FeCl3，室温放置 75 mM phosphate buffer (pH 7.0)，用磷酸氢二钾和磷酸氢二钾配制 10 mM DTT，冰浴 0.5% (wt/vol) NEM，冰浴 4% (wt/vol) α-α-bipyridyl，用70%乙醇溶解，冰浴 ASA标品根据样品浓度配制（标曲）试验步骤：植物材料（约40mg）分装到离心管中，并立即在液氮中冷冻；加入1mL 6% TCA 到2 mL离心管中，离心（13000 g, 4℃ 5min），并将上清液转移到一个新的2mL离心管中。（所有提取物保持在冰上并立即开始测定）；抗坏血酸试验测定空白、标准和样品，同时测定还原型AA和总AA（每个样品四次测定）；加入10μl 75mM磷酸盐缓冲液和20μl 6% TCA（空白），AA标准品(0.15 -10mM)或20μl 上清至96 孔板；加10μl 10mM DTT到离心管中，室温孵育10分钟；加10 0.5% NEM到提取总AA管中除去多余的DTT并孵育至少30 s；加20μl水至还原型AA测定管中，将DTT和NEM的体积加到总AA测定试管中；加入50μl 10% TCA, 40 μl 43% H3PO4, 40 μl 4% α-α-bipyridyl 和 20 μl 3% FeCl3 至所有测定管中； 37℃孵育 1 h；测定525nm下吸光值。计算：