基因工程 载体 项目三 载体.pptVIP

包装蛋白分为互补两部分：一部分缺少E组份，另一部分缺少D组份。 * 噬菌体密度已达1013 -1014 / L， * l-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达 外源基因 * * pUC18 / 19： lacZ’ 的显色原理 lacZ a MCS b-半乳糖苷酶a-亚基(N端） 5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷 X-gal IPTG诱导 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c b a 表达 b a 蓝色产物 无色底物 水解 作业：请文字说明蓝白班筛选的原理 外源基因 1、白色菌落 2、蓝色菌落 3、白色菌落 β亚基 作业：请文字说明上述3种情况的原因 TA克隆载体 原理: PCR时，Taq酶具有末端转移酶活性，在PCR产物 3’末端加一个A; pGEM经EcoRV 切平后，3’ 末端加一个T。 优点: 避免载体自身环化； PCR产物无需酶切，可直接与载体连接； A A T T S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 质粒提取 一般有三种方法制备质粒 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染 碱裂解法 质粒DNA纯度低、快速、操作简便 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 质粒分离纯化 碱裂解法： 缓冲液悬浮菌体 加NaOH和SDS混合溶液，裂解细菌 加醋酸钾溶液，去除染 色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，苯酚-氯仿萃取 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA cccDNA L-DNA ocDNA S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 质粒分离纯化 沸水浴法： 用含有EDTA和Triton X-100的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 沸水浴40秒钟 离心，用无菌牙签挑去沉淀物 乙醇或异丙醇沉淀质粒DNA S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 噬菌体或病毒DNA 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物 能高效率高特异性地侵染宿主细胞 自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中 在一定的条件下上述两种状态还相互转化。 因此，它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体。 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 噬菌体侵染模式 (1)附着到细菌外表面，将自身的DNA注入宿主细胞。 (2)噬菌体DNA分子复制。 (3)合成衣壳蛋白，新的噬菌体被组装，从细菌中释放。 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 溶菌状态 l噬菌体感染大肠杆菌 DNA整合到宿主染色体上 不产生子代噬菌体颗粒。 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c l 噬菌体感染周期 溶原状态 l DNA载体构建 l 噬菌体结构 由衣壳蛋白和l-DNA组成 l-DNA全长48502 bp，线状双链-DNA 至少有61个基因 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c GGGCGGCGACCT CCCGCCGCTGGA COS位点 两端各有12碱基互补突起, 称为cos位点，可被λ编码的末端酶所识别 COS位点 COS位点 体内 体外 S h a f c 上 海 农 林 职 业 技 术 学 院 S h s f c 野生lDNA本身长度：48.5kb 衣壳蛋白包装lDNA的上限：51kb， 插入的外源DNA片段：不能大于2.5kb 包装范围：原DNA的75-105% 48502×0.75=36.4 48502×1.05=51 即可包装 36.4 - 51 kb 构建 第一步：缩短l DNA长度 缩短野生型l DNA的长度，以提高装载量。 野生lDNA约有40-50%序列非必需，可切除。 l DNA左臂：编码衣壳蛋白 l DNA中臂：控制溶原生长序列，一般被切除 l DNA右臂：重要调控序列 根据切