实验四 cDNA的合成.docVIP

实验四 cDNA的合成 1．目的与要求： 掌握cDNA的合成方法。 2．实验原理 cDNA的合成是进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的基础。RT-PCR的原理是利用组织或细胞中的总RNA, 以其中的mRNA作为模板, 采用Oligo (dT)或随机引物, 利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,从而获得目的基因或检测基因表达。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 对于cDNA第一链的合成, 目前试剂公司有多种cDNA第一链的试剂盒出售, 其基本原理相同, 但操作步骤不一。 3. 仪器设备： 高压灭菌锅、烘箱、恒温水箱、制冰机、蜗旋震荡器、台式微量离心机、移液枪等。 4. 实验材料：1.5ml、2ml、200ul离心管、一次性枪头等。 5. 试剂： 5.1 TIANScript M-MLV。 5.2 Frist-Strand buffer(含有DTT)。 5.3 RNasin。 5.4 2.5mmol/L dNTP Mix。 5.5 0.1mol/L DTT。 5.6 RNase-free ddH2O。 5.7 Oligo(dT)15。 5.8 RNase H。 6. 实验步骤 6.1 在冰浴的0.2ml微量离心管中, 加入总RNA 1～5μg（实验二）、 2μl Oligo(dT) 15 、2ul dNTP，补充适量的DEPC水使总体积达14.5μl,轻轻混匀。 6.2 将混合液置于70 oC水浴中加热5min, 立即将微量离心管插入冰浴中2min。简短的离心收集反应液后加入以下各组分：4ul 5x Frist-Strand buffer(含有DTT)，0.5ul RNasin。 6.3 加1ul（200U）TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀。如果用随机引物，请将离心管置25oC温浴10分钟。 6.5 在42 oC孵育50min。 6.6 置95 oC加热5min 终止反应。置冰上进行后续试验或冰冻保存。 6.7 将离心管插入冰中, 加入RNase H 1μl, 37孵育20min降解残留的RNA, 然后95 oC加热5min使酶失活, -70oC保存备用。