DB37∕T 1827-2011 猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术(山东省).pdfVIP

TCS B41 65. 020. 30 DB37 东 h E tTJ 巳 省 标 准 方 山 DB 37/ T 1827一-2011 猪圆环病毒2 型荧光 PCR 检测技术 Real-time PCR Assay for the Detection ofPorcine Circovirus Type 2 2011 - 04 - 08 发布 2011 - 06 - 01 实施 发布 山东省质量技术监督局 DB37/ T XXXX--XXXX 目IJ 1=1 本标准按照 GB!T 1.1-2009 给山的规则起草。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由山东省农业科学院提出。 本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位:山东省农业科学院畜牧兽民研究所。 本标准主要起草人:王金宝、李f瓷、吴家强、 H寸建\r.~吴晓燕、丛晓燕、乎也文|尊、杜以军。 DB37/ T XXXX--XXXX 猪圆环病毒 2 型荧光 PCR 检测技术 1 范围 ;本标准规定了猪圆环病毒2型 (PCV2) 荧光PCR检测技术的要求。 本标准适用于猪血洁和细织中猪圆环病毒2型的检测。 2 材料 2.1 器材 2.1.1 微量移液器(最大量和为 10μL、 20μL、 100μL、 1000~L) 2.1.2 20 OOOg 高速冷冻离心机 2.1.3 紫外分光光度il 2.1.4 PCR 仪 2. 2 荧光定ltl: PCR 仪试剂 2.2.1 质粒提取试剂命 2.2.2 SYBR Green 1 核酸染料 2. 2. 3 凝胶回收试剂盒 2.2.4 蛋白酶K( 见附录A. 1 章) 2. 2. 5 10%SDS 液(见附录A. 2 章) 2. 2. 6 70% 乙醇(见附录A. 3 章) 2. 2. 7 1%琼脂糖凝胶(见附录A. 4 章) 2.2.8 DNA Marker 2000 2. 3 寻|物 Y1: 5-GCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTT-3, Y2: 5-GAGTGGGCTCCAGTGCTGTTAT-3 , 3 方法 3.1 质粒标准阳性模板的制备 3.1.1 质粒的构建及鉴定 利用普通PCR技术扩增出PCV2 的ORF2基因702bp片段，凝胶回收日克隆到克隆载体。 纯化质粒，并转化DH5a 感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定。 3.1.2 重组质粒浓度的测定 将阳性重细质粒作20倍稀释，用紫外分光光度计测定其浓度，并计算标准品的拷贝数。 3.1.3 标准品制备 10 e ì 6 0 将重要H 质粒稀释至l. 0 X 10