中药综合检验技术 高效毛细管电泳法 高效毛细管电泳法.doc

分析化学教研室 第十九章 高效毛细管电泳法 【知识目标】 1．熟悉：高效毛细管电泳法基本原理、基本装置和应用。 2．了解：高效毛细管电泳主要分离模式及其特点。 【能力目标】 1．识别：高效毛细管电泳法基本概念、基本装置；主要分离模式及其特点。 2．理解：高效毛细管电泳法基本原理、基本装置和应用。 案例分析 案例分析19-1 高效毛细管电泳法测定奶制品中三聚氰胺 三聚氰胺（melamine），分子式C3N6H6，化学名为“1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺”，俗称“蛋白精”，是一种氮杂环有机化工原料。由于该分子中含有大量氮元素，所以不法分子在饲料以及乳制品中违法添加三聚氰胺以提高产品“蛋白质含量”，而采用通常的“凯氏定氮法”是难以区分这种伪蛋白的存在。2007年宠物饲料中含有三聚氰胺导致部分宠物生病甚至死亡，美国法律禁止食品中添加三聚氰胺。2008年由于三聚氰胺出现在三鹿婴幼儿乳粉中，导致数千婴幼儿产生不良反应甚至死亡，我国卫生部等五部门随即颁布公告规定，婴幼儿配方乳粉中三聚氰胺的限量值为1mg·kg?1，液态奶（包括原料乳）、奶粉及其他配方乳粉中三聚氰胺的限量值为2.5mg·kg?1。 利用高效毛细管电泳法测定奶制品中三聚氰胺含量，试样前处理简单，无需柱分离及衍生化，方法准确、灵敏、简单、经济，能满足有关规定的三聚氰胺限量值的测定。 问题： 1．何谓高效毛细管电泳法？有何特点？ 2．高效毛细管电泳法基本原理如何？与高效液相色谱法有何不同？ 3．高效毛细管电泳法在药物分析和食品检测中有哪些应用？ 高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据试样中各组分之间淌度和（或）分配行为的差异而实现各组分分离的分析方法。它是经典电泳和现代微柱分离技术相结合的产物，是分离科学中继高效液相色谱之后的又一个重大进展，它使分离科学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析成为可能。 与高效液相色谱相比，高效毛细管电泳柱效更高，理论塔板数可达到105～106 m–1；分离速度更快，数十秒至数十分钟内可完成一个试样分析；运行成本极低，试样用量仅为数纳升，缓冲溶液消耗只需几毫升至几十毫升，毛细管柱和仪器简单，价格低廉；分离模式更多，应用广泛，从无机离子至单细胞、单分子，从小分子至大分子，都可进行分离分析。高效毛细管电泳优点，可概括为“高效、低耗、快速、应用广泛”。但在迁移时间的重现性、进样的准确性、检测的灵敏度方面稍逊于高效液相色谱法。 近年来高效毛细管电泳在进样技术、柱技术、检测技术、分离机制、生物医药食品应用等方面迅速发展，成为分离分析领域一个重要的发展方向。 第一节 基本原理 一、基本概念 （一）电泳和淌度 在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所带电荷相反电场方向迁移的现象称为电泳（electrophoresis）。阳离子向负极方向迁移，而阴离子向正极方向迁移，中性物质不带电，不发生电泳。 在充满自由溶液的开口管中球形离子的电泳速度公式为 （19-1） 式中r、q分别为离子半径和电荷数，η为溶液粘度，E为电场强度。 式（19-1）表明，当电场强度一定时，离子电荷不同，离子半径不同，离子电泳速度不同。大小相同的离子，所带电荷越多，电泳速度越快；相同电荷的离子，离子半径越小，电泳速度越快。这就是区带电泳分离不同离子的理论基础。 在毛细管电泳中，常用淌度（mobility，μ）来描述带电粒子的电泳行为和特性。电泳淌度（μep）定义为单位电场下离子的平均电泳速度，即 （二）电渗流 毛细管电泳通常采用石英毛细管柱，其表面等电点pI≈3，当溶液pH大于3时，其表面硅醇基（SiOH）电离以SiO- 存在，使管内表面带负电。当它和溶液接触时，由于静电作用吸附溶液中带相反电荷的离子，形成双电层。这种液-固表面双电层存在一定电位差，称为Zeta电势（ζ）。Zeta电势受管壁材料及其表面特性和溶液性质的影响。为了区分带电粒子和管壁的Zeta电势，用ζe表示带电粒子Zeta电势，用ζw表示管壁Zeta电势。 当毛细管柱两端外加电场时，双电层中阳离子向阴极移动，由于离子是溶剂化的，所以带动了毛细管中溶液整体向阴极移动，产生电渗流（electroosmotic flow，EOF）。相当于HPLC的压力泵加压驱动流动相流动。电渗速度，用veo表示。 以电场力驱动产生的溶液电渗流，与HPLC由压力泵产生的液体流型不同，如图19-1所示。电渗流的流型为扁平流型（flatflow），或称为“塞流”。HPLC流动相流型则是抛物线型的层流（lam