HAT培养基及有限稀释法原理.pdfVIP

HAT 培养基中含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)三种成分。 前提：①细胞的DNA 碱基合成有内源性途径(主要途径)和外源性途径(旁路途径)两种方式。 ②内源性途径就是利用二氢叶酸还原酶 （名字不重要，但后面会提到）的催化下来合 成DNA ③外源性途径则是利用次黄嘌呤 （H）或胸腺嘧啶 （T）补救合成DNA 原理：HAT 培养基中氯基喋呤是二氢叶酸还原酶的抑制剂, 能有效地阻断DNA 合成的内源性 途径。B 淋巴细胞有外源性途径的酶, 因此在内源性途径被阻断后仍能利用HAT 培养 基中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶通过外源性途径来合成DNA，可在HAT 培养基中存活, 但 B 淋巴细胞是正常细胞, 它虽然可以活下来，但不能长期存活 （顶多10-50 代）。 杂交瘤技术中所使用的骨髓瘤细胞是研究人员选出来，刚好不能合成外源性途径的酶 的缺陷细胞, 缺乏外源性途径的酶会使它在内源性途径被阻断后也不能进行DNA 的外 源性合成，故不能在HAT 培养基中存活。但杂交瘤细胞 （融合后的）由于继承了B 淋 巴细胞和骨髓瘤细胞的双重特性，能够合成外源性途径的酶，故在HAT 养基中能长期 存活。因此将融合后的混合细胞在HAT 培养基中培养两周后，只有杂交瘤细胞能存活 下来 （B 淋巴细胞死于“两周”，骨髓瘤死于HAT 培养基），成为制造单克隆抗体的 细胞源。 有限稀释法：筛选阳性株一般只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长， 经有限稀释 （让它使劲稀释，直到不存在一个孔里两个及以上，只要有大于一 的就继续稀释，一般都按以前总结的经验，稀释倍数都是固定的），按Poisson 法计算，应有36％的孔为1 个细胞/孔，剩下孔的没有细胞 （稀释的太猛）。 细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用抗原（有标记）检测抗体 含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔 （强调高分泌），将孔中 细胞再行克隆化 （让它复制），尔后进行抗原特异的测定，选高分泌特异性 细胞 （强调特异性，也就是可以分泌你想要抗体的那一个杂交瘤细胞）株扩大 培养或冻存。